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西北民族大学生物技术专业本科毕业论文第9页共9页1硫酸镁注射液中细菌内毒素的检测专业：生物技术姓名：鲁红兰指导教师：李倬摘要：目的：探讨采用鲎试剂法对硫酸镁注射液进行细菌内毒素检查的可行性。方法：按《中国药典》2005年版二部收载的细菌内毒素检查方法进行实验。确定硫酸镁注射液细菌内毒素的限值，用标示灵敏度为0.25Eu/ml的鲎试剂检测其细菌内毒素，考察硫酸镁注射液对细菌内毒素法检查的干扰作用。结果：硫酸镁注射液稀释至75倍，对细菌内毒素无干扰作用。结论：本文建立的硫酸镁注射液细菌内毒素检查法是可行的，该药可采用细菌内毒素检查法控制药品质量。关键词：硫酸镁注射液；细菌内毒素检查；干扰试验；ABSTRACTObjective:ToexplorethefeasibilityofdetectingbacterialendotoxinsinMagnesiumSulfateinjectionbytechypleusamebocylelysate.Methods:TheexperimentwasconductedaccordingtobacterialendotoxinstestprocedureandguildingprincipleinChinesePharmacopeia2005(Ⅱpart).Thelimitofendotoxinswasdetermined,thebacterialendotoxinscouldbetestedbyTALofwhichsensitivityshowedas0.25EU/ml,theinterferenceofMagnesimsulfateinjectiontotheprocessofbacterialendotoxinswasstudied.Results:MagnesiumSulfateinjectionhasnointerferencetobacterialendotoxinstest.Whenitisdilutedfor75times.Itisfeasibiletodetect西北民族大学生物技术专业本科毕业论文第9页共9页2bacterialendotoxinsinMagnesiumSulfateinjectionbyTALtest.Conclusion:ThemethodofbavterialendotoxintestcanbeusedcontrolthequalityofMagnesiumsulfateinjection.Keywords:Magnesiumsulfateinjection;Endotoxintestmethod;Interferencetest硫酸镁注射液为硫酸镁的灭菌水溶液，可作为抗惊厥药，具有镇静、镇痉与减低颤压等作用。其中Mg2+可抑制中枢神经—肌肉接头乙酰胆碱的释放，降低或解除肌肉收缩作用，同时对血管平滑肌有舒张作用，临床上适用于痉挛、惊厥、子痫症、尿毒症、破伤风与高血压性脑病等。硫酸镁注射液一次最大用量为4g，用25%葡萄糖注射液20ml稀释后5分钟内缓慢静脉注射。在注射给药过程中，偶尔引起恶心、呕吐、心慌、头晕等症状，将这种药物不良反应称之为热原反应。而已知内毒素具有热源活性，能够引起热原反应，对机体产生致病作用。细菌内毒素是G菌细胞壁的脂多糖成分，于细菌死亡解体后释放。其在体内作用于单核巨噬细胞产生多种炎症细胞，如肿瘤坏死因子、白细胞介素、干扰等等。这些因子适量时可激活免疫系统对机体产生有益作用，过量时引起机体严重病理生理反应，其对组织细胞损伤远远超过内毒素本身对机体的直接影响。它作为外源性的致热源，作用于粒细胞和单核细胞，使之释放内源性致热源，引起发热；它可以激活血管活性物质的释放，导致低血压及其发生休克，同时它可活化凝血因子Ⅻ，导致弥漫性血管内凝血。西北民族大学生物技术专业本科毕业论文第9页共9页3因此，检测细菌内毒素即致热物质的含量已成为药品质量控制的重要指标。《中国药典》明确规定注射液应采用细菌内毒素或热源检查法控制药品的质量【1】.而自20世纪60年代建立鲎试剂方法以来，细菌内毒素检查法在药品生物制品内致热物质的检查中，作为热源法的补充，具有检测快速、重现性好、准确等优点。此法是利用鲎血变性细胞制成的鲎试剂与微量内毒素产生凝集反应的现象，作为判断样品中细菌内毒素是否符合规定的一种方法。它的主要原理是内毒素Ca2+Mg2+同鲎试剂中的β因子凝固酶、凝固蛋白质等发生一系列酶催化的级联反应。为了将细菌内毒素检查法应用于本品的质量控制，本实验参照《中国药典》2005年版二部附录“细菌内毒素检查法”【2】对硫酸镁注射液细菌内毒素的检查方法进行了实验研究。1.仪器和试药：硫酸镁注射液（批号：0103141.0103142.013151.规格：10ml.2.5g,常州市兰陵制药有限公司）;细菌内毒素工作标准品（批号：，规格：10Eu/支，湛江安度斯生物制品有限公司）;细菌内毒素检查用水（批号：，规格2ml/支，湛江安度斯生物制品有限公司）;鲎试剂（批号，规格0.1ml/支，标示灵敏度λ=0.25Eu/ml,湛江安度斯生物制品有限公司）；漩涡混合器；电热恒温水浴；精密可调加样器（200ml，1000ml）。小试管，试管架，封口膜，剪刀，脱脂棉，定时钟，砂轮，实验所用玻璃器皿经250℃烘烤1小时去除外源细菌内毒素，避免导致假阳性的后果，以西北民族大学生物技术专业本科毕业论文第9页共9页4确保实验结果的准确性。2.方法和结果：2.1细菌内毒素限值L的计算【3】一般而言，注射剂等药品的细菌内毒素检查属于一种限度试验，因此，首先必须确定供试品的细菌内毒素限值，当供试品含内毒素低于这个限值时，按规定给药途径用药，不引起热原反应，反之亦然。样品内毒素限值的确定在很大程度上与临床所用的人体最大给药剂量有关，剂量越大，单位重量或体积的内毒素限值越低。在确定内毒素限值时首先根据公式L=K/M，其中，K为规定的给药途径，即人用每千克体重每小时可接受的内毒素的剂量，一般注射剂规定的K值为5.0Eu.(kg.h)-1;M为每小时每千克体重可接受的最大剂量，以mg.(kg.h)—1表示，人均体重按60kg计算，根据说明书，硫酸镁注射液最大给药剂量为4g/60kg/1h。计算L=K/M=[5Eu/(kg.h)]÷[4000mg/60(kg.h)]=0.075Eu.mg-12.2最大有效稀释倍数的确定大多数情况下，鲎试剂的灵敏度值小于供试品的内毒素限值，因此需要用细菌内毒素检查时用水对供试品进行稀释，如果直接用供试品原液试验，导致供试品的内毒素限量提高，势必影响实验结果，因此需要计算供试品有效稀释倍数,即MVD。它表示在所选择的鲎试剂灵敏度条件下，对产品进行最大倍数的稀释，仍能够进行内毒素限制的检测。西北民族大学生物技术专业本科毕业论文第9页共9页5根据公式MVD=Lc／λ，其中L为供试品细菌内毒素的限值即L=0.075Eu/mg.c为供试品的浓度，即c=250mg/ml;λ为鲎试剂标示灵敏度，以EU/ml，表示目前市售鲎试剂常用灵敏度，为0.5-0.03EU/ml,故选用λ为0.25EU/ml的鲎试剂。计算本品的最大有效稀释倍数MVD=Lc／λ=(0.75EU/mg×250mg/ml)／0.25EU/ml=75倍2.3TAL灵敏度复核：鲎试剂灵敏度的准确性，直接影响检验结果的可靠性【4】。鲎是栖生在海洋的低等无脊椎动物，它受到各种生活环境影响，很难避免存在个体差异【5】。鲎试剂又是一种含有多种电泳成分的蛋白质类物质，其中总蛋白量及多种金属离子的浓度，对鲎试剂灵敏度影响很大。周海钧(1988）曾经报道过，我国用东方鲎试剂对7种不同来源的内毒素做敏感试验，证明鲎试剂对不同来源的内毒素敏感度相差很大，最大差距竟达114.5倍【6】。因此，为了避免检测同一检品时用相同标示值的鲎试剂出现不同的结果，试验前需要复核鲎试剂的灵敏度。2.3.1细菌内毒素标准溶液的制备：细菌内毒素标准品是用于鲎试验时的对照品，它是用世界卫生组织内毒素国际标准品来标定的，其单位用EU/ml。而细菌内毒素工作标准品是以细菌内毒素国家标准品为基准标定效价，用以试验中鲎试剂灵敏度复核，干扰试验设置的多种阳性对照。本标准溶液的制备中，取细菌内毒素工作标准品一支（10Eu/支），以酒精棉球消毒瓶颈启开，吸取BET水1ml溶解，以封口膜将瓶口封西北民族大学生物技术专业本科毕业论文第9页共9页6严置漩涡混合器上混匀15min,即为10Eu/ml的内毒素标准溶液。由于内毒素的化学成分与结构等原因，造成检测到内毒素含量很低，因此在检测前需要利用漩涡装置充分振荡。根据鲎试剂灵敏度的标示值，将细菌内毒素标准品分别制2.0λ，1.0λ，0.5λ，0.25λ，共四个浓度的内毒素标准溶液。即：10Eu/ml→1Eu/ml→0.5Eu/ml→0.25Eu/ml→0.125Eu/ml→0.0625Eu/ml。即：0.1ml的内毒素标准溶液+0.9ml的BET水→0.5ml的内毒素标准溶液+0.5ml的BET水→：0.5ml的内毒素标准溶液+0.5ml的BET水→：0.5ml的内毒素标准溶液+0.5ml的BET水→：0.1ml的内毒素标准溶液+0.9ml的BET水。2.3.2待复核鲎试剂准备在制备内毒素标准品的同时，取0.1ml/支的鲎试剂18支，以酒精棉球消毒瓶颈启开，在此操作中应避免异物掉入安郶瓶造成鲎试剂污染，每支按标量加入0.1ml的BET水溶液，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。将上复溶后鲎试剂溶液混合后，分配至20支管备用。2.3.3加样将待复核鲎试剂放在试管架上，排成五列，前四列每列四支第五列两支，1至4列分别加入相当于待测鲎试剂灵敏度2.0λ，1.0λ，0.5λ，0.25λ的内毒素标准溶液0.1ml,每一浓度重复四次，第五列为阴性对照加入BET水0.1ml.加样结束立即用封口膜封口，混匀，避免产生气泡，连同试管架放入37℃±1℃水浴锅中，保温60±2分钟后观察，西北民族大学生物技术专业本科毕业论文第9页共9页7将凝集管倒转180°，如反应混合物已凝固，且不发生变形者为阳性，其他均为阴性，并记录结果。2.3.4鲎试剂灵敏度计算内毒素浓度(Eu/ml)0.5（2λ）0.25（λ）0.125(0.25λ)0.01625(0.25λ)Nc反应终点浓度重复管1++---0.252++---0.253++--0.25数4++--0.25由上表可知最大浓度2.0λ的4管均为阳性，最低浓度0.25λ的4管均为阴性，阴性对照均为阴性，根据结果结算鲎试剂灵敏度复核结果（λc）λc＝lg-1(∑X/4)=lg-1[(lg0.25+lg0.25+lg0.25+lg0.25)/4]=0.25(Eu/ml)该批鲎试剂灵敏度标值为（λ）=0.25，实验结果λ为0.5～2.0λ，故该批鲎试剂灵敏度复核符合规定.2.4供试品干扰试验由于细菌内毒素检查法是鲎试剂和内毒素在模拟的生理环境下进行的一种酶促反应，因此受许多生化因素影响。受检样品中可能存西北民族大学生物技术专业本科毕业论文第9页共9页8在许多干扰因素，如多糖激活鲎试剂旁路，使常规内毒素试验呈阳性，【7】蛋白质对细菌内毒素有显著的屏蔽作用，而影响鲎试剂法测定细菌内毒素的结果。【8】因此我们在进行对每种供试品内毒素检查之前，应首先进行干扰试验，确定该样品在试验浓度下是否对鲎试剂有干扰。2.4.1供试品溶液的制备为了避免影响实验结果，供试品需要用BET水对其进行稀释。根据以上计算的硫酸镁注射液最大有效释放倍数即MVD=75倍，以BET水稀释供试品，即稀释75倍。取此溶液0.1ml,即:250mg/ml→50mg/ml→1.6mg/ml硫酸镁注射液备用（稀释75倍），即，（0.1ml的供试品溶液+2.4ml的BET用水→0.1ml的供试品溶液+0.2ml的BET用水）2.4.2供试品内毒素溶液的制备取制备好的内毒素标准溶液（1.0Eu/ml）0.5ml+0.5ml供试品溶液（1.6mg/ml）→