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1微量铁的测定可见分光光度法2OBJECTIVE1掌握分光光度法的基本原理2学会光度法测定物质的含量3学习可见分光光度计的使用方法3PRINCIPLE有色物质对光的吸收具有选择性，溶液的不同颜色是由于溶液中有色物质选择地吸收各种颜色的光引起的。有色溶液的颜色实质上是它所选择吸收的光的互补色.当一束白光通过铁黄色络离子溶液时，兰色光大部分被吸收，其它色光透过.4Beer-Lamber:当一束单色光通过有色溶液时部分吸收，部分透过，有色物质对光的吸收度(吸光度A)与有色物质的组成量度(C)和液层厚度(L)的乘积成正比.A=KLC=-lgT=-lgII0A:吸光度(absorbance)K:吸光系数(absorptivity)L:液层厚度C:溶液组成量度T:透光率(transmitance)I0ILC5Beer-Lamber：物质对单色光吸收的强弱与吸光物质浓度和厚度关系的定律Beer：吸光与浓度的关系Lamber：吸光与厚度间的关系II0透光率(transmitance,T)A=-lgT吸光度(absorbance)E吸光系数(absorptivity)6吸收光谱(吸收曲线)7标准曲线A=KLCA=K’C8可见分光光度法:是对于能吸收可见光的有色溶液的测定方法，对于许多不吸收可见光的无色物质可以用显色反应使之变成有色物质。91显色反应及其条件因素：试剂与溶剂、酸碱度、时间、温度及其它操作时，必须在平行原则的条件下进行2测定方法：标准曲线法(空白溶液作对照)：消除溶剂或其它物质对入射光吸收等因素溶剂空白：显色剂及制备试液的其它试剂均无色；可用溶剂作空白溶液试剂空白：显色剂有色；按显色反应相同条件下加入各种试剂和溶剂(不加试样溶液)试样空白：试样基体有色，显色剂无色；不加显色剂但按显色反应相同条件进行操作10Fe3++3Fe33-+6H+HOHOOCSO3HOOOCSO3-H显色剂：磺基水杨酸pH1.8~2.5淡紫色4.0~8.0橙红色8.0~11.5黄色12沉淀吸收波长：380~480nm范围内，选择最大吸收波长λmax(425nm)Fe(C7H4O6S)+Fe(C7H4O6S)2-Fe(C7H4O6S)33-Fe(OH)3实验条件：11PROCEDURE1系列标准溶液和待测溶液的配制编号空白123456未知标准溶液(ml)0.000.501.001.502.002.503.001.00(待测液)10%磺基水杨酸(ml)5.00HOAc-NaOAc缓冲液(ml)10蒸馏水稀释至50.00ml122标准曲线的制作波长425nm下，以空白溶液为参比溶液，分别由稀至浓测定一系列标准溶液的吸光度．以Fe3+含量为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线．编号空白123456Fe3+含量(mg/ml)吸光度(A)波长425nm133试样注入比色皿，插入试样槽调节波长至425nm盖上样品室盖，将空白试样移入光路按A/T/C/F键，切换至A明亮按△/100%键，使A值显示为0.000(即置空白试样为0.000)推或拉SAMPLE依次测试标准系列溶液A值1接通电源，预热30min2打开样品室盖，按△/0%键,使T显示000.0可见分光光度计操作：140ACC样品A样品相同条件下，测定未知溶液的吸光度，然后从标准曲线上查出Fe3+的含量.3未知铁盐溶液中Fe3+含量的测定15表1微量铁含量测定结果DATA编号空白123456未知Fe3+标准溶液(ml)0.000.501.001.502.002.503.001.00(待测液)10%磺基水杨酸(ml)5.00HOAc-NaOAc缓冲液(ml)10蒸馏水稀释至50.00ml波长425nmFe3+含量(mg/ml)吸光度(A)16QUESTION&DISCUSSION1本实验中的空白溶液能不能用蒸馏水代替？为什么？2为什么加入试剂的量、顺序和时间要一致？