肿瘤细胞与分化、凋亡(一)

肿瘤细胞与分化、凋亡(一)源于一位权威专家的课件，和大家一起分享前言大量研究证明，肿瘤的发生是多因素、多阶段、多基因共同作用的结果。其特点是多因素（环境因素，如物理、化学、生物等；机体因素，如遗传、免疫、年龄与性别等）交互作用，有的起致癌作用，即诱导细胞恶性转化，有的起促癌作用。肿瘤的发生发展经历了启动、促发、侵袭、转移等阶段。并且，各阶段都可能发生多种癌基因激活、抑癌基因失活。表现为增生过度、分化异常、凋亡受阻。长期以来，“细胞一旦癌变后，就永远是癌细胞”的观点一直统治着肿瘤学领域，即恶性肿瘤是不能逆转的。在这种思想指导下，传统的肿瘤治疗不外乎外科手术切除、化疗、放射或免疫治疗。1971年，Friend报告小鼠红白血病细胞（MEL）可被二甲基亚砜（DMSO）诱导分化，开创了肿瘤细胞分化研究的先河。目前，诱导肿瘤细胞分化的已经成为重要研究前沿。细胞分化与肿瘤一、肿瘤细胞诱导分化的有关概念1.分化(differentiation）细胞分化是指幼稚的胚胎细胞生长发育为各种不同形态结构和功能代谢的成熟细胞的过程。如人起源于一个受精卵，通过细胞分裂形成内、中、外三个胚层细胞。2.反分化(retro-differentiation)又称去分化(dedifferentiation)，肿瘤的反分化是指细胞恶变后，细胞的多种表型又回到胚胎细胞表型的现象。恶性肿瘤细胞表现分化异常，不成熟。3.再分化（redifferentiation）又称逆转（reversion），它是指在分化诱导剂的作用下，恶性肿瘤细胞被诱导而重新向正常细胞的方向演变分化，表现为形态学、生物学、生物化学等诸多指标均向正常细胞接近，甚至完全转变为正常细胞。二、分化诱导剂1.内源性分化诱导剂内源性分化诱导剂是由肿瘤或宿主细胞产生的具有分化诱导作用的化学物质。它有以下几种：⑴集落刺激因子（CSF）：分为CSF-M和CSF-G；⑵粒细胞巨噬细胞分化因子（GM－DF）；⑶类固醇类化合物：如糖皮质激素和1，25-（OH）2-vitD3；⑷细胞因子:如TNF-α和INF-γ；⑸糖脂:如神经节苷脂GM3；⑹其它，如cAMP等。2.外源性分化诱导剂可分为以下几类：⑴无机化合物：亚硒酸钠等。⑵简单的有机化合物：正丁酸、二甲基亚砜(DMSO)、六次甲基二乙酰胺(HMBA)等。⑶维生素A类化合物：维甲酸、AM80、芳维甲等。⑷佛波酯类化合物：12-O-十四酯酰佛波-13-乙酸(TPA)。⑸抗生素类：放线菌素D、丝裂霉素等；⑹抗癌药：6-巯基嘌呤、5-氮胞嘧啶等。三、诱导肿瘤分化的研究1.体外分化诱导模型(1)白血病细胞分化诱导模型最常用的是急性髓性白血病细胞株HL-60。它在分化诱导剂作用下可出现分化表型如形态上由早幼粒白血病细胞分化为中、晚幼粒、杆状核细胞和分叶核细胞，生化方面出现硝基蓝四氮唑还原性（NBT），功能方面出现吞噬活性及趋化性，生物学方面丧失了在软琼脂培养基上形成集落及裸鼠体内移植成活的能力。(2)实体瘤分化诱导模型人胃癌分化诱导模型国内外有人用DMSO、HMBA、suramin、维甲酸、大蒜油及大蒜与其烯丙基硫化合物等处理胃癌细胞株时，癌细胞在形态结构、功能代谢和生物学等方面均出现分化特征。人神经母细胞瘤分化诱导实验在正丁酸、苯丁酸及其盐类作用后，瘤细胞可形成树突状结构，功能上能产生神经递质合成酶，生物学上其致瘤性明显降低，表现出分化的特点。人粘液表皮样癌分化诱导实验MEC-1细胞是上皮样细胞，体外增殖迅速，形态异型性明显，裸鼠体内成瘤性，在HMBA的作用下出现分化表型：生长抑制、核异型性降低、表面微绒毛减少、胞浆内粗面内质网增加和出现特征性的成熟分泌颗粒、DNA含量减少及倍体趋向二倍体等。其它实体瘤分化诱导模型其它实体瘤如黑色素瘤、肝癌、前列腺癌、胶质母细胞瘤、肺癌等均有报道。2.体内分化诱导模型目前，体内分化诱导尚无理想的模型。人白血病细胞一般采用小鼠腹腔扩散法及裸鼠皮下移植法;人实体瘤采用小鼠肾包膜下移植和裸鼠移植建立分化诱导模型。分化诱导效果主要根据肿瘤生长抑制和荷瘤鼠生命延长，细胞标记酶、抗原以及形态的变化来判断。国内用NB4细胞株建立了SCID小鼠人APL腹水细胞模型，在ATRA作用下能发生分化，如明显提高NBT还原率和CD11b的表达，小鼠的生存期明显延长。该模型的建立是评价新的或已有的治疗APL药物和临床前期实验研究的理想模型。3.分化诱导的临床试验尽管诱导分化研究取得了成绩，但其最终目的是能应用于临床，ATRA治疗APML能有效地达到临床缓解，被认为是人类恶性肿瘤分化治疗的成功典范。ATRA能诱导APL病人恶性肿瘤细胞分化成熟，口服ATRA可使大多数患者达到完全临床缓解，即使是传统化疗失败后亦是如此。在欧洲的随机实验证实，ATRA加化疗比单用化疗方案能明显降低复发率和延长生存期。四、诱导肿瘤细胞分化的调控机制1.核内受体途径维甲类化合物诱导肿瘤细胞分化主要通过核内受体途径。维甲酸受体(RAR)是广泛存在各种组织细胞核内的一类受体蛋白，有RARS和RXRS两类，每一类又有α、β、γ三种类型，比较其DNA序列和结构特点，二者属于类固醇-甲状腺素-vitD3受体在内的核内受体超家族。在细胞液内存在RA结合蛋白，能将RA从细胞浆运输到核内染色体上的受体部位，自身则释放回到胞浆。RA经胞质内RA结合蛋白运输到染色体上的受体部位，与核受体以二聚体形式结合某些靶序列，进而引起特定基因的转录激活或转录抑制来诱导细胞分化。Manfredini等用ATRA和vitD3诱导白血病母细胞分化实验中发现，M0、M1对二者不敏感，M3在ATRA诱导下向粒细胞方向分化，M2则在二者诱导下向单核细胞分化。进一步研究方发现，ATRA和vitD3有效地增加核内VDR，VDR与RXR形成二聚体，再结合到DR3型VD反应元件，从而激活VD反应元件调控的报告基因的转录，启动了M2向单核细胞方向分化。2.影响基因转录Naka等用9-cis-维甲酸诱导胃癌细胞株分化研究中，发现大多数胃癌细胞株能合成RARs和RXRsmRNA，其中一些细胞株并不停滞于G0/G1期，但可一过性增加p21WAF1蛋白表达，降低CDK7、EGFR及cyclinD蛋白量，减少Rb基因产物磷酸化。认为9-cis-维甲酸抑制细胞生长是通过调控细胞周期，影响维甲酸受体mRNA转录来实现的。Okabe发现TPA可诱导Ph’阳性白血病细胞MC3向巨核细胞系分化，血小板糖蛋白GPⅡb表达增强，GPⅡbmRNA水平增高，处理组有GATA-1表达，而GATA-3不表达，未处理组仅GATA-2转录。TPA则通过影响GPⅡb及GATAs转录来诱导MC3细胞分化。Garingo在诱导MEL分化中发现红细胞特异性基因转录活化，PKA缺陷时则转录出现障碍。转录因子NF-E2是提高球蛋白位点控制区活性的必须成分。DNA与NF-E2结合，α-球蛋白位点控制区增强子活性在PKA缺陷细胞中明显低于具有PKA活性的细胞，PKA对转录因子的调控影响了红细胞特异基因转录而诱导MEL细胞分化。研究表明，染色质重塑在基因转录调控中有重要作用，而组蛋白乙酰化、去乙酰化修饰是影响染色质重塑的重要因素。我们前期研究的基础上，建立人胃癌MGC803细胞裸鼠移植瘤模型，以被证实有显著诱导肿瘤细胞分化的药物丁酸钠（Sodiumbutyrate,SB）为阳性对照，观察DADS（diallyldisulfide）在体内外诱导MGC803细胞分化时，对其核组蛋白乙酰化表达的调控作用，以及二者之间的关系，进一步探讨DADS对MGC803细胞抑制和诱导分化的作用机理。TreatmentfactoresAveragedensity(OD)050100150200250ControlDADS(15mg/L)DADS(30mg/L)DADS(60mg/L)SB(5mM)SB(5mM)andDADS(30mg/L)H3β-actinDADS(mg·L-1):─153060─30SB(mM):────55DADS对体外培养MGC803细胞组蛋白乙酰化的影响TreatmentfactoresAveragedensity(OD)050100150200250ControlDADS(15mg/L)DADS(30mg/L)DADS(60mg/L)SB(5mM)SB(5mM)andDADS(30mg/L)H4β-actinDADS(mg·L-1):─153060─30SB(mM):────55DADS对体外培养MGC803细胞组蛋白乙酰化的影响0153060DADScontertations(mg/L)Averagedensity(OD)02040608010012014016012h24hp21WAF1β-actin处理时间（h）:12h24h12h24h12h24h12h24hDADS(mg·L-1):00151530306060DADS对MGC803细胞p21WAF1蛋白表达的影响DADS对各组移植瘤组织中乙酰化组蛋白表达的影响GroupsAveragedensity(OD)050100150200250NSSB(66mg/kg)DADS(50mg/kg)DADS(100mg/kg)DADS(200mg/kg)H3β-actin各处理因素：NSSBDADSDADSDADS浓度(mg·kg-1)：—6650100200GroupsAveragedensity(OD)050100150200250NSSB(66mg/kg)DADS(50mg/kg)DADS(100mg/kg)DADS(200mg/kg)H4β-actin各处理因素：NSSBDADSDADSDADS浓度(mg·kg-1)：—6650100200DADS对移植瘤细胞p21WAF1表达的影响GroupsAveragedensity(OD)020406080100120140160180200NSSB(66mg/kg)DADS(50mg/kg)DADS(100mg/kg)DADS(200mg/kg)p21WAF1β-actin各处理因素：NSSBDADSDADSDADS浓度(mg·kg-1)：—66501002003.对癌基因和抑癌基因的影响细胞的基因控制细胞的生长与分化，而这些基因的变化则影响基因的表达或功能被认为是癌变的主要原因。Ras基因在细胞内有H-，K-，N-Ras，编码分子量为21kd的蛋白，p21Ras蛋白具有GTP酶活性。Ras能使3T3细胞恶性转化，促使细胞增殖。C-myc过表达可以促进基因转录和细胞分裂，与肿瘤的形成关系密切。P53基因编码P53蛋白，P53蛋白有野生型和突变型，野生型P53基因具有抑制细胞增殖和转化的作用。李晓光等用大蒜油诱导MGC803细胞分化和凋亡研究中，发现处理组细胞形态接近正常细胞，细胞的致瘤性明显下降，Northern杂交有P53和P21表达增强，提示大蒜油通过促进抑癌基因P53、P21的表达，抑制细胞恶性增殖、诱导凋亡和促进细胞分化。王代树等用HMBA诱导MGC803细胞分化时发现C-myc和C-H-ras表达抑制。Naka用9-顺-维甲酸诱导胃癌细胞分化时则有P21蛋白一过性增加。这些基因在诱导癌细胞分化过程中的改变进一步影响其调控的基因表达而实现瘤细胞分化的效应。我们发现，DADS作用下，MGC803细胞明显抑制，且呈剂量-效应依赖关系；瘤细胞对ConA的凝集率、集落形成率与ALP比活性下降；瘤细胞异形性降低，核浆比下降，细胞表面微绒毛数目减少，胞浆内细胞器丰富，胞核及部分细胞器呈退行性变，可见细胞间连接结构；细胞骨架蛋白合成增加与重组，细胞间缝隙连接通讯功能恢复，提示DADS可诱导MGC803细胞分化。DADS处理后的MGC803细胞S期细胞含量减少，G2期细胞含量增加，细胞停滞于G2期，p21WAF1、Rb表达增强，p21ras、c-Myc、突变型p53表达减弱。表4DADS作用MGC803细胞96小时后OD570值n＝6DADS（μg/ml）0对照454035302520X0.73