第二章-菌种选育、保藏与复壮

第二章菌种选育、保藏与复壮Contents第一节食品发酵与酿造工业菌种第二节菌种选育第三节菌种保藏与复壮第四节国内外主要菌种保藏机构第一节食品发酵与酿造工业菌种2020/2/294一、现代发酵工业对菌种的要求（1）非病源菌，不产生有害活性物或毒素；（2）发酵周期短，发酵产物的产生能力强；（3）高转化，易分离纯化，低成本，高质量；（4）生长繁殖力强，速度快，较强产孢能力；（5）原料广，价廉，易被微生物利用、转化；（6）对添加的前体物质有耐受能力；（7）菌种纯，遗传特性稳定，抗噬菌体能力强。二、现代发酵工业常见菌种类别微生物名称产物用途细菌短杆菌谷氨酸食用、医药短杆菌肌苷酸食用、医药枯草杆菌淀粉酶葡萄糖、糊精、酒精发酵、啤酒酿造枯草杆菌蛋白酶酱油速酿、饲料巨大芽孢杆菌葡萄糖异构酶由葡萄糖制造果糖酵母菌酒精酵母酒精医药、食用假丝酵母单细胞蛋白酵母菌体蛋白脆壁酵母乳糖酶食品工业霉菌黑曲霉柠檬酸食用、医药黑曲霉柚苷酶、酸性蛋白酶柑橘罐头脱除苦味黑曲霉单宁酶、糖化酶分解单宁、酶精制、酒精发酵工业栖土曲霉蛋白酶同枯草杆菌蛋白酶根霉糖化酶、甾体激素葡萄糖制造、酒精厂糖化、医药毛霉蛋白酶腐乳生产青霉菌葡萄糖氧化酶蛋白除葡萄糖、脱氧、食品罐头贮存木霉菌纤维素酶淀粉和食品加工、饲料黄曲霉菌淀粉酶食用、化工红曲霉糖化酶、红曲色素葡萄糖制造、酒精厂糖化、调色剂米曲霉蛋白酶酱油酿造枯草芽孢杆菌戊糖片球菌植物乳杆菌多粘类芽孢杆菌酿酒酵母粉状毕赤酵母红葡萄浓缩汁中的酵母菌形态产朊假丝酵母黑曲霉黑曲霉青霉米曲霉蛋白酶、淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等根霉绿色木霉产生微晶纤维素酶，羧甲基纤维素酶、纤维二糖酶，可完全水解纤维素。拟康氏木霉产生纤维素酶，羧甲基纤维素酶、纤维二糖酶，可完全水解纤维素。第二节菌种选育一、新菌种的分离与筛选利用人工环境，使样品中目标微生物成为优势菌。样品来源越广泛，获得新菌种的可能性越大。纯种分离的常用方法有平板划线分离法、稀释分离法和涂布分离法。样品采集富集培养分离纯化一般生产性能的测定通过初筛和复筛的方法来确定。性能鉴定（一）样品采集①原则样品来源越广泛，获得新菌种的可能性越大。②土壤采样方法土壤的有机质含量和通风状况（5～25cm深度）土壤的pH和植被状况地理条件季节条件细菌、放线菌：耕地、菜园和近郊土壤；酵母菌：果园树根的土壤中；霉菌：动植物残体及霉腐土层中；黑曲霉：稻场、谷物堆积处。•pH＜7.0：霉菌、酵母菌居多•pH7.0～7.5：细菌、放线菌丰富（二）富集培养①富集培养的目的利用人工环境，使样品中目标微生物成为优势菌。②富集培养的方法控制培养基的营养成分控制培养条件③富集培养的方式分批培养（Batchculture）连续培养（Continuousculture）分批补料培养（Fed-batchculture）2020/2/2926（三）纯种分离（1）平板划线分离法（2）稀释分离法（3）涂布分离法（4）毛细管分离法（5）小滴分离法2020/2/2928初筛和复筛（1）初筛（定性——粗放！）①平板筛选（变色圈、透明圈、生长圈、抑菌圈）②摇瓶发酵筛选（2）复筛（定量——精确！）1个菌株重复3～5瓶，精确分析如酶活力单位、耐酒精程度等。溶磷细菌的平板筛选(5d)青霉菌溶磷实验高效溶磷的真菌菌株（四）性能鉴定生产性能测定通常使用初筛和复筛的方法确定。直接从自然界分离得到的菌株为野生型菌株。我们常将这些自然界中直接获得的新菌株称为进一步育种工作的原始菌株或出发菌株。毒性试验若毒性大而且无法排除者应予以淘汰。种属鉴定菌种种属的鉴定•鉴定工作的内容（1）测定一系列必要的鉴定指标；（2）查找权威鉴定手册，确定菌种类型。•鉴定方法（1）经典的分类鉴定方法：形态学特征；生理生化特征；血清学试验与噬菌体分型；氨基酸顺序和蛋白质分析（2）现代分类鉴定方法：微生物遗传型；细胞化学成分；数值分类法二、自然选育自然选育的定义利用微生物在一定条件下产生自发变异，通过分离、筛选，排除劣质性状的菌株，选择出维持原有生产水平或具有更优良生产性能的高产菌株，达到纯化与复壮菌种、保持稳定生产性能的目的。其主要原理是微生物群体分离。自然选育的方法（1）通过表现形态淘汰不良菌株；（2）考察目的代谢产物产量；（3）进行遗传基因型纯度试验，考察菌种纯度；（4）传代稳定性试验：斜面传3-5代。自然选育资料显示，某些芽孢杆菌具有分解和利用葡聚糖的能力，请设计方案从自然界中筛选一产葡聚糖酶的菌株，并简要分析各主要步骤的依据。05年江南大学微生物(发酵)考研试题三、诱变育种诱变育种：指人为地、有意识地将对象生物置于诱变因子中，使该生物体发生突变，从这些突变体中筛选具有优良性状的突变株的过程。提高了菌种发生突变的频率和变异幅度，提高获优机率。突变：在自然状况下发生的突变—自然突变（10-6~10-9）诱变：人为地利用物理或化学因素诱发的突变（10-4~10-5）诱变剂：能够显著提高突变频率的物理或化学因素。（一）常见诱变剂及作用基本原理物理诱变因子紫外线、X射线、快中子等化学诱变因子硫酸二乙酯（DES）、亚硝酸、吖啶橙生物诱变因子噬菌体、转座子等（二）诱变基本方法及影响因素诱变剂的选择：作用机理；突变谱诱变剂量选择：最适剂量（致死率70-80%时）增效（变）剂：氯化锂（0.5%）外部环境条件：如温度、氧气、pH、水分出发菌株的选择：生产菌株、野生菌株出发菌株的生理状态：细菌--对数生长期；幼年孢子；营养体；湿态敏感（真菌：106cfu/mL孢子悬浮液；细菌：108cfu/mL的菌液）诱变效应的测定：直接法和浓缩法，培养后测定目的产物量诱变方法：单因子、复合诱变优良突变株的筛选方法：随机筛选或半理性化筛选（三）诱变育种流程第三节菌种保藏与复壮一、菌种的衰退菌种衰退（degeneration）生产菌种或筛选出来的较优良菌株，由于进行接种传代或保藏之后，群体某些形态特征及生理特征逐渐减退甚至完全丧失的现象。由于菌种的自发突变使其典型性状，特别是产量性状发生负变的现象。菌种退化的主要表现①产量下降，目的代谢产物减少，原料转化率下降；②生长速度缓慢，目的代谢产物合成能力下降，发酵周期延长；③产孢子能力变弱，孢子形成数量减少；④抗逆性减弱；⑤形态畸形等。（一）引起菌种退化变异的因素遗传基因型的分离丝状真菌、多细胞组成、有的单核、有的多核，遗传物质基础有多样性的复杂性，为群体繁殖，往往出现遗传基因型的分离---数量遗传的自体调节现象。自发变异的产生负向变异为多数，结果：目的代谢产物产量下降，生长逐步变弱变慢，孢子形成能力低下等。原因：长期保藏；频繁传代（例斜面保藏、发酵厂种子制备）；菌体在代谢过程中产生具有诱变作用的物质；存在增变。人工诱变导致的退化变异基因突变（退化的根本原因）连续传代（加速退化的直接原因）（二）衰退的防止控制传代次数：不超过7代，易变异的不过5代砂土管、冻干管保藏的原种，开启不能超过3次，以防污染。选择良好保藏方法：保证菌不死、不衰、保存活性及原有典型性状良好的培养条件：注意斜面菌株的培养条件（保藏、活化培养基）采用不同类型的细胞进行接种产孢子霉菌细菌二、菌种的复壮广义——是指在菌种的生产性状尚未衰退前，就经常有意识的进行纯种分离和生产性能的测定，从而使菌种的生产性能逐步提高的一种措施。狭义——指菌种已经发生衰退后，再通过纯种分离和性能测定的办法从衰退的群体中找出尚未衰退的个体，以达到保持该菌种原有典型性状的一种措施。复壮的方法纯种分离淘汰已衰退的个体通过寄主体进行复壮（一）纯种分离菌落纯用稀释平板法或平板划线法，取得单细胞菌落，再通过菌落和菌的特征分析和性能测定，获得具有原来性状或性状更好的菌株。菌株纯（细胞纯）只有菌丝的：在显微镜下用毛细管挑取只有一个核的菌；有孢子的：在显微镜下用毛细管挑取单个孢子。一般只要求达到菌落纯的水平——用于退化不太严重的情况。纯度操作方法适用情况菌落纯稀释平板法、划线法、表面皿法退化不严重菌株纯（细胞纯）单细胞分离法（或二者结合）退化不严重（二）淘汰已衰退的个体可通过物理、化学方法处理菌体或孢子，使其大部分死亡(80%以上)，存活的菌多为生长健壮者，从中选出优良菌株。用10%酒精处理，能耐之的一般为原菌株（啤酒酵母）。在培养基内加青霉素，抗药性较强的细菌一般为原菌株(产抗生素)。适当提高培养温度加乳酸，淘汰酸奶菌种中的衰退个体。一般可将单菌落分离与培养条件综合进行复壮，效果更好2020/2/2946（一）保藏原理根据微生物的生理、生化特性，人工地创造条件，使之达到不死、不衰、不污染的休眠状态。（二）菌种保藏方法①斜面低温保藏法（最简单的菌种保存法）②矿油保藏法③载体吸附保藏法④冷冻真空干燥法（最佳的微生物菌体保存法之一）⑤液氮超低温保藏法（当前最理想的保存法）低温、干燥、缺氧、缺营养三、菌种的保藏CICC保藏菌种GIMCC保藏菌种请从保藏原理、保藏适应对象、保藏期及优缺点等方面对各种保藏方法进行比较说明。2020/2/2950保藏方法保藏原理适用菌种保藏期优点缺点斜面低温液体石蜡油保藏砂土管保藏冷冻真空干燥液氮超低温2020/2/2951保藏方法保藏原理适用菌种保藏期优点缺点斜面低温低温霉菌,放线菌,酵母菌,细菌均可霉菌,放线菌及有芽孢细菌4-6月;酵母菌3月;无芽孢细菌约1月简便有效，适合非长期保藏的菌种保期短,传代频繁,易变异液体石蜡油封保藏低温、缺氧霉菌,放线菌,酵母菌霉菌,放线菌,芽孢细菌2~3年,酵母菌1-2年,无芽孢细菌约1年制作简单，不需特殊设备，且不需常移种直立保存,不便携带，不适石蜡碳源或敏感者砂土管保藏低温、缺氧、缺营养细菌芽孢,霉菌、放线菌的孢子2-5年简单易行工作量大,费人力，不适干敏性无孢菌冷冻真空干燥低温(-20℃以下)、干燥、缺氧除少数不产孢子只产菌丝体的丝状真菌外均可5-10年保藏期长，成活率高需特定设备、操作繁琐,要求严格液氮超低温超低温(-150～-196℃)各类微生物10年以上保存时间长需特殊设备，操作复杂第四节国内外主要菌种保藏机构单位简称单位名称单位简称单位名称CCCCM中国微生物菌种保藏管理委员会NICPBP卫生部药品生物制品检定所ACCC中国农业微生物菌种保藏中心MCCC中国海洋微生物菌种保藏管理中心CICC中国工业微生物菌种保藏中心CACC中国抗生素微生物菌种保藏中心CMCC中国医学微生物菌种保藏中心IMB中国医学科学院医学生物学研究所CGMCC中国普通微生物菌种保藏中心SIA四川抗生素研究所ISF中国农业科学院土壤与肥料研究所IANP石家庄华北制药厂抗生素研究所AS中国科学院微生物研究所CVCC中国兽医微生物菌种保藏中心IFFI中国食品发酵工业研究院NCIVBP农业部兽药监察研究所AS-IV中国科学院武汉病毒研究所CFCC中国林业微生物菌种保藏中心CCTCC中国典型培养物保藏中心(武大)RIF中国林业科学院林业研究所表国内主要菌种保藏机构表国外主要菌种保藏机构单位简称单位名称单位简称单位名称ATCC美国典型菌种保藏中心NIBH日本国家生命科学和人类技术研究所NRRL美国农业研究菌种保藏中心IFO日本大阪发酵研究所CSH美国冷泉港实验室IAM日本东京大学应用微生物研究所CBS荷兰微生物菌种保藏中心CCTM法国典型微生物保藏中心KCTC韩国典型菌种保藏中心CMI英联邦真菌研究所DSMZ德国微生物菌种保藏中心SSI丹麦国立血清研究所UKNCC英国国家菌种保藏中心IMI国际真菌学研究所（英国）节主要内容知识点一酿造工业菌种工业菌种质量要求；常用菌种类型二菌种选育新菌种的分离与筛选；自然选育；诱变育种（突变，诱变，诱变剂，诱变作用机理，影响诱变效果的因素，诱变方法）；其它育种技术三衰退复壮与保藏菌种衰退(主要表现；引起菌种退化变异的因素；防止菌种衰退的措施)；复壮（广义、狭义；方法）；菌种保藏（原理、方法比较）四保藏机构国内机构；国外机构本章小结思考题1.发酵工业用菌