抑制消减杂交的原理及应用

抑制消减杂交的原理及应用尚立娜甘肃省肿瘤医院主要内容抑制消减杂交的定义1抑制消减杂交的基本原理及实验过程2抑制消减杂交技术的优点3抑制消减杂交技术的应用4甘肃省肿瘤医院基因的选择性表达决定了生物体的各项生命活动动抑制消减杂交的定义人类基因组包括100000个不同的基因，但对于每个细胞而言一般只有15000种基因表达要了解人体各项生命活动的分子调控机制，就必须将这些差异表达的基因分离、鉴定作深入研究抑制消减杂交甘肃省肿瘤医院抑制消减杂交的原理抑制性消减杂交技术的定义：是一种鉴定、分离组织细胞中选择性表达基因的技术.其原理是以杂交二级动力学和抑制性PCR反应为基础的cDNA消减杂交技术.通过合成两个不同的接头，连接于测试cDNA片段的5’末端，达到选择性扩增差异性表达的cDNA片段，抑制非目的cDNA的扩增.该技术与其他消减杂交技术相比假阳性率低、敏感性高、效率高等优点而得到广泛应用.甘肃省肿瘤医院抑制消减杂交的原理杂交二级动力学原理：即丰度高的单链DNA在退火时产生同源杂交的速度快于丰度低的单链DNA，从而使原来在丰度上有差别的单链DNA相对含量达到基本一致。抑制PCR原理：利用链内退火优于链间退火的特点，使非目的序列片段两端反向重复序列在退火时产生类似发卡的互补结构，无法作为模板与引物配对从而选择性地抑制了非目的基因片段的扩增。甘肃省肿瘤医院巢式PCR反应：巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应(PCR)，使用两对（而非一对）PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。第二对引物称为巢式引物，结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。巢式PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此，巢式PCR的扩增非常特异性巢式PCR示意图甘肃省肿瘤医院抑制消减杂交的原理甘肃省肿瘤医院抑制消减杂交的实验过程杂交双方为tester和driver,tester含有要寻找的差异表达基因合成dscDNA:提取待比较的两组细胞的mRNA，利用3‘端引物将mRNA反转录为cDNA，根据真核生物mRNA序列3'端具有polyA结构的特点，合成3'端引物.反转录体系中要加入T4DNA聚合酶以产生平头cDNA。tester准备:产生平头dscDNA后，用RsaI或HaeⅢ限制性内切酶将dscDNA酶切成短片段，将testercDNA分为两组，在T4连接酶的作用下分别在cDNA的5‘端连上两个不同的寡聚核苷酸接头(接头1和接头2).接头1和接头2分别是具有一段反向末端重复序列的寡核苷酸序列，以利于以后的选择性扩增。甘肃省肿瘤医院抑制消减杂交的实验过程driver准备:对于driver的dscDNA只需经RsaI或HacⅢ限制性内切酶酶切成短片段，而不需添加接头。消减杂交:分别向两个tester样品中加入过量的drivercDNA，于杂交缓冲液中进行杂交反应。第一轮杂交反应完毕后，将两个tester样品混合，再加入过量变性的drivercDNA继续杂交反应。获得作为PCR扩增模板的差异表达序列。PCR反应:杂交产物中两端连有不同接头的片段就是所寻找的差异表达基因。经补平末端后进行巢式PCR扩增以获得所需要的差异表达基因。甘肃省肿瘤医院抑制消减杂交的实验过程消减文库的克隆:经巢式PCR扩增得到所需要的差异表达基因后，利用TA克隆法将差异表达基因转化感受态大肠杆菌，根据蓝白斑筛选原理，筛选出转化成功的阳性菌落。最后根据插入片段的两端接头引物进行巢式PCR反应对插入片段进行特异性扩增。PCR-TOPO载体(T载体的一种)甘肃省肿瘤医院抑制消减杂交的实验过程※TA克隆构建原理：TA克隆系统由Invitrogen公司发展而来的商业性试剂盒，它用于PCR产物的克隆和测序。其原理是利用Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3’T突出端的载体，在连接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR产物直接插入到质粒载体的多克隆位点（MCS）中。甘肃省肿瘤医院抑制消减杂交的实验过程※蓝白斑筛选原理：大肠杆菌（β-半乳糖苷酶缺陷型菌株）β-半乳糖苷酶可分成2部分即α肽段和C-段。α肽段的基因位于载体上并含有不影响其ORF（openreading）的多克隆位点（MCS），而C-段的基因位于工程菌E.coliDH5α上。二者在同一菌株中表达时，菌株中的C-段与载体上的α肽段互补而具有酶活性，能将无色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。在MCS上插入新基因将会改变其ORF而使得载体上的α肽段不能与菌株中的C-段互补而不能将无色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝而产生白斑。选择转入的阳性克隆即选择白斑。大肠杆菌甘肃省肿瘤医院抑制消减杂交的实验过程蓝白斑筛选示意图甘肃省肿瘤医院抑制消减杂交的实验过程分子杂交定义：确定单链核酸碱基序列的技术。其基本原理是待测单链核酸与已知序列的单链核酸（叫做探针）间通过碱基配对形成可检出的双螺旋片段。这种技术可在DNA与DNA，RNA与RNA，或DNA与RNA之间进行，形成DNA-DNA，RNA-RNA或RNA-DNA等不同类型的杂交分子。人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交甘肃省肿瘤医院抑制消减杂交的实验过程1.探针的制备探针是一段标记核酸序列，可与靶序列互补形成杂交双链，通过检测杂交链信号即可对靶序列DNA的存在及其分子大小加以鉴别.探针可以是克隆的，也可以是合成的。用PCR扩增产物可制备探针。也可用提纯的质粒进行标记制备探针核酸甘肃省肿瘤医院RNA探针合成寡核苷酸探针cDNA探针基因组探针抑制消减杂交的实验过程探针种类探针的种类甘肃省肿瘤医院抑制消减杂交杂交的实验过程探针的标记方法放射性同位素标记：常见的为32P,它能量高信号强。放射性同位素具辐射危害和半衰期限制。光敏生物素标记：标记简单，但是效率较低，对于短探针不宜使用。生物素标记:将生物素链接在核酸探针上，利用亲和素对生物素有极高亲和力的原理，分子杂交后用亲和素或链酶亲和素进行检测酶促生物素标记：生物素与dUTP中尿嘧啶的C5相连，在聚合酶作用下掺入DNA地高辛标记：地高辛与UTP中尿嘧啶的C5相连。荧光素标记：用荧光素标记核酸；用荧光素标记抗生物素蛋白或抗地高辛抗体。甘肃省肿瘤医院InSituHybridizationNorthernblottingWesternblotting抑制消减杂交的实验过程SouthernblottingdotblottingPCR-Southern杂交2核酸分子杂交方法的分类甘肃省肿瘤医院抑制消减杂交的实验过程杂交主要方法及应用mRNA样品经电泳分离后，转移到硝酸纤维素膜上，与放射性标记的DNA探针进行杂交，经放射自显影，即可检测特异性mRNA分子在样品中存在与否及其长度大小斑点杂交是将DNA或RNA样品直接点在硝酸纤维素滤膜上，然后与核酸探针分子杂交以显示样品中是否存在特异的DNA或RNA。利用类似Southern印迹法的方法对蛋白质进行印迹分析，蛋白质经单向电泳分离后被转移到硝酸纤维滤膜上，然后用放射性或酶标记的特异抗体来检测相应抗原的存在。Westernblotting2将DNA电泳转印到固相支持物上，用探针（DNA/DNA杂交）进行检测的方法。是基因分离和鉴定的重要手段，广泛用于遗传多态性分析southernblotting13northernblotting4dotblotting甘肃省肿瘤医院抑制消减杂交的实验过程※斑点杂交：将核酸点在能与核酸结合的膜（硝酸纤维素膜、尼龙膜、聚偏氟乙烯膜等）上，经80℃烘烤或紫外光照等处理使核酸固定在膜上，然后与标记探针进行分子杂交，用放射自显影或非放射性显色检测。并做定性或半定量分析。斑点杂交点膜甘肃省肿瘤医院抑制消减杂交技术的优点抑制消减杂交技术的优点1234本技术对高、低丰度的差异表达基因都能有效分离。主要原因是该技术利用了杂交二级动力学原理简便易行及重复性好：本技术所采用的方法简单、成熟、易掌握，易操作，且假阳性率低灵敏度高：用抑制消减杂交技术仅需要1~2ug的mRNA快速：应用这种方法一般3~4天即可获得差异表达基因片段的cDNA甘肃省肿瘤医院抑制消减杂交技术的应用器官发育——睾丸特异表达基因的研究免疫学——T细饱杂交瘤比较获得一个新的TNF家族成员TRANCE基因，编码产物能调节T细胞依赖免疫反应肿瘤——大鼠高转移细胞株与低转移细胞株的比较应用信号转导——NF-KB和IAP(凋亡抑制剂)参与TNF诱导细胞死亡信号转导的研究甘肃省肿瘤医院