第四章-代谢工程的基本思想

代谢工程MetabolicEngineering第四章代谢工程的基本思想生物合成途径的遗传控制2生物发酵条件的控制2生物发酵条件的控制3代谢工程基本概念1代谢工程实例4一、基本概念微生物群体的活动是一个动态过程伴随能量形式的转换而发生的电子流动伴随异化和同化作用而发生的物质流动伴随不同水平上的代谢调节而发生的信息流动一、基本概念反应:途径:网络:ABABCDABCED一、基本概念ABCED反应中间代谢物激活的反应失活的反应底物产物一、基本概念ABCED交换代谢流胞内代谢流代谢流和碳架物质流：代谢物在代谢途径中流动形成代谢流。在代谢工程领域，代谢流往往是指碳架物质流一、基本概念代谢主流的变动性和选择性、载流途径一、基本概念理想载流途径一、基本概念代谢网络、代谢网络的联网一、基本概念代谢网络的节点微生物代谢网络中的途径的交叉点（代谢流的集散处）称作节点，在不同条件下，代谢流分布变化较大的节点称为主节点。节点分为柔性、弱刚性、强刚性节点代谢网络的刚性微生物自动抵制代谢网络中代谢物流量分布的改变的特性叫做代谢网络的刚性。代谢网络的刚性与主要刚性节点的刚性大小、分布及数量密切相关代谢物流分析一种计算流经各种途径的物流的技术，用于描述不同途径的相互作用以及围绕支点的物流分布一、基本概念代谢控制分析通过某一途径的物流和以流量控制系数来表示的酶活之间的定量关系。流量控制被分布在途径的所有步骤中，只是若干步骤的流量比其他的更大些，可用数学方程来描述代谢网络内的控制机制。流量控制系数流量的百分比变化除以某一酶活（该酶能引起流量的改变）的百分比变化称为流量控制系数弹性系数表示酶催化反应速率对代谢物浓度的敏感性。弹性系数是个别酶的特性微生物代谢的人工控制微生物在正常情况下，通过细胞内自我调节，维持各个代谢途径的相互协调，使其代谢产物既不少又不会过多的积累，而人类利用微生物进行发酵则需要微生物积累较多的代谢产物，为此对微生物的代谢必须进行人工控制人工控制微生物代谢的方法主要有两种改变微生物的遗传特征控制发酵条件五字策略：进、通、节、堵、出二、生物合成途径的遗传控制二、生物合成途径的遗传控制遗传改造营养缺陷型抗反馈调节产物降解酶缺失增加前体物的合成细胞膜组分缺失营养缺陷型营养缺陷型（auxotroph）：野生型菌株经诱变剂处理后，由于发生了丧失某种酶合成能力的突变，因而只能在加有该酶合成产物的培养基中才能生长的突变菌株野生型（wildtype）：从自然界分离到的、发生营养缺陷型突变前的原始菌株原养型（prototroph）：营养缺陷型经回复突变或重组，回到原来野生型的营养要求二、生物合成途径的遗传控制营养缺陷型终产物D对途径第一个酶有反馈抑制或阻遏作用。选育失去C——D的能力的D的营养缺陷型突变株，在培养基中添加D使之足以维持生长，但不足引起反馈抑制与阻遏，则解除了D对此途径的反馈调节，那么中间产物C得以大量积累。这类菌株不能积累末端产物，只能积累中间产物无分支途径二、生物合成途径的遗传控制营养缺陷型谷氨酸棒杆菌鸟氨酸生物合成途径①乙酰谷氨酸合成酶②乙酰谷氨酸激酶③NO乙酰谷氨酸醛脱氢酶④乙酰鸟氨酸转氨酶⑤乙酰鸟氨酸乙酰基转移酶⑥鸟氨酸氨甲酰基转移酶⑦精氨琥珀酸合成酶⑧精氨琥珀酸酶二、生物合成途径的遗传控制营养缺陷型当菌株失去C——D的能力即D或E缺陷型突变株。解除了E、G对第一个酶的协同反馈调节。当培养基中限量添加E，那么只剩下G对C——F转变的控制。F、G不会过量生成，而使C得以积累分支途径二、生物合成途径的遗传控制营养缺陷型双缺陷型突变株。F-、D-分支途径二、生物合成途径的遗传控制营养缺陷型菌株失去了F——G的能力，因此限量添加G可以积累F分支途径二、生物合成途径的遗传控制营养缺陷型通常I、E协同反馈调节途径第一个酶，但该菌株丧失了C——F的能力，是I、G的双缺陷型突变株。若在培养基中亚适量添加I、G，那么就解除了I、E对第一个酶的协同反馈调节，使终产物E大量积累，所以只要选育F-或G-、I-缺陷型突变株就可以积累E分支途径二、生物合成途径的遗传控制天冬氨酸甲硫氨酸苏氨酸赖氨酸中间产物Ⅰ天冬氨酸激酶中间产物Ⅱ抑制高丝氨酸高丝氨酸脱氢酶不能合成营养缺陷型二、生物合成途径的遗传控制渗漏缺陷型渗漏缺陷型是一种不完全营养缺陷型，它不会产生过量的末端产物，因而可以避开反馈调节。但它又能合成微量的末端产物，用来进行生物合成；在培养这种突变体时，可不必在培养基中添加相应的物质，就能积累所需的产物二、生物合成途径的遗传控制抗反馈调节在以积累末端产物为目的的发酵生产中，如果代谢途径单一无分支，往往不能选用营养缺陷型突变株。要提高产量，最好采用抗反馈调节突变株抗反馈调节突变株由于基因突变，它们的酶或无活性的原阻遏物不再与末端产物结合，从而不再发生酶的变构及阻遏物的活化，或者活性阻遏物不能再与发生了突变的操纵基因结合，因此反馈调节被打破，即使在末端产物过量的情况下，也同样可以积累高浓度的末端产物选育抗结构类似物的突变株从营养缺陷型回复突变株中获得对途径中调节酶解除反馈抑制的突变株二、生物合成途径的遗传控制抗结构类似物抗反馈突变株通常可以用添加末端产物结构类似物的方法来筛选。末端产物类似物和末端产物结构类似，因而能够引起反馈，但是它们不能参与生物合成在培养基中添加末端产物类似物后，未突变的细胞将由于代谢途径受阻而不能获得生物合成所需的该种末端产物，从而导致细胞死亡。那些对类似物不敏感的突变体，则由于原来受反馈控制的酶的结构，或是酶的合成系统已经发生了改变，它们不再受抑制或阻遏的影响，在类似物充斥的情况下照常能合成该种末端产物苏氨酸α-氨基-β-羟基戊酸二、生物合成途径的遗传控制回复突变调节酶的变构特性是由它的结构基因决定的，若调节酶因编码它的基因发生突变而失活，则有两种可能：编码催化亚基与调节亚基的基因发生了变化编码催化亚基（或活性部位）的基因发生变化若通过再次突变，使调节酶的活性恢复，这时又有两种可能：催化亚基和调节亚基恢复（或大体恢复）到第一次突变前那样的状态催化亚基得到恢复，而调节亚基却丧失了调节作用，这情况实质上是编码调节亚基的DNA突变，解除了反馈抑制作用调节酶的失活与否，可能直接表现为某种营养缺陷型。可以采用营养缺陷型的回复突变的方法，从营养缺陷型回复突变株中获得对途径中的调节酶解除反馈调节的调节突变株二、生物合成途径的遗传控制产物降解酶缺失为了使产物在发酵液中稳定地存在，以提高发酵单位，可通过诱变获得缺乏降解产物酶的突变株原产物生长菌株NTG、DES、UV完全培养基产物为唯一碳源的基本培养基（-）葡萄糖培养基生长因子（+）诱变选育二、生物合成途径的遗传控制增加前体物的合成通过选育某些营养缺陷型或结构类似物抗性突变株以及克隆某些关键酶的方法，增加目的产物的前体合成，有利于目的产物的大量积累二、生物合成途径的遗传控制细胞膜组分缺失生物素缺陷型油酸缺陷型甘油缺陷型温度敏感突变株添加表面活性剂添加青霉素二、生物合成途径的遗传控制细胞膜组分缺失生物素缺陷型使用生物素缺陷型菌株进行谷氨酸发酵，通过限制发酵培养基中生物素的浓度控制脂肪酸生物合成，从而控制磷脂的合成作用机制：生物素作为催化脂肪酸生物合成最初反应的关键酶乙酰CoA羧化酶的辅酶，参与脂肪酸的合成，进而影响磷脂的合成。当磷脂合成减少到正常量的一半左右时，细胞变形，谷氨酸向膜外漏出，积累于发酵液中二、生物合成途径的遗传控制细胞膜组分缺失油酸缺陷型使用油酸缺陷型菌株进行谷氨酸发酵，通过限制发酸培养基中油酸的浓度而控制磷脂的合成作用机制：由于油酸缺陷突变株阻断了油酸的后期合成，丧失了自身合成油酸的能力；即丧失脂肪酸生物合成能力，必须由外界供给油酸，才能生长。故油酸含量的多少，直接影响到磷脂合成量的多少和细胞膜的渗透性；通过控制油酸亚适量，使磷脂合成量减少到正常量的1/2左右时，细胞变形，谷氨酸分泌于细胞外二、生物合成途径的遗传控制细胞膜组分缺失甘油缺陷型使用甘油缺陷型菌株进行谷氨酸发酵，通过限制发酵培养基中甘油的浓度而控制磷脂的合成作用机制：甘油缺陷突变株的遗传阻碍是丧失α-磷酸甘油脱氢酶，所以自身不能合成α-磷酸甘油和磷脂，必须由外界供给甘油才能生长。在甘油限量供应下，由于控制了细胞膜中与渗透性有直接关系的磷脂含量，从而使谷氨酸得以积累二、生物合成途径的遗传控制细胞膜组分缺失温度敏感突变株与谷氨酸分泌有密切关系的细胞膜的结构基因上发生碱基的转换或颠换，突变基因所指导翻译的酶，在高温时失活，导致细胞膜某些结构的改变。发酵过程中，在温度转换之后，进行适度地剩余生长，完成从谷氨酸非积累型细胞向谷氨酸积累型细胞的转变，仅通过采用控制温度就能实现谷氨酸高产二、生物合成途径的遗传控制细胞膜组分缺失添加表面活性剂表面活性剂作为生物素的拮抗物具有抑制脂肪酸的合成作用，导致磷脂合成不足，结果形成磷脂不足的细胞膜，提高了细胞膜对谷氨酸的渗透性添加青霉素抑制转肽酶活性，破坏细胞壁合成二、生物合成途径的遗传控制基因工程基因扩增——强化代谢合成途径异源基因导入——引入新的代谢反应基因突变——改变酶学性质基因敲除——阻断代谢通路代谢网络重构与优化二、生物合成途径的遗传控制三、生物发酵条件的控制当菌株选育（内因）确定后，环境条件（外因）合适与否是发酵成败的重要因素。环境条件既影响微生物生长，又影响代谢速度和方向及产物形成与积累内因外因环境因素对谷氨酸发酵影响三、生物发酵条件的控制发酵控制要解决的两个问题发酵代谢途径问题---副产物少发酵代谢速度问题---产物生成速率快调控发酵条件包括发酵温度、发酵醪基质浓度、含氧量、酸碱度、发酵时间控制方法有:通风、供热（冷）、调节培养基、流加补料三、生物发酵条件的控制四、柠檬酸发酵黑曲霉利用糖类发酵生成柠檬酸其生物合成途径是，葡萄糖经EMP、HMP途径降解生成丙酮酸，丙酮酸一方面氧化脱羧生成乙酰CoA，另一方面经CO2固定化反应生成草酰乙酸，草酰乙酸与乙酰CoA缩合生成柠檬酸生长期与产酸期都存在EMP与HMP途径，前者EMP:HMP=2:1，后者EMP:HMP=4:1黑曲霉柠檬酸产生菌中存在TCA循环与乙醛酸循环，在以糖质原料发酵时，当柠檬酸积累时，TCA和乙醛酸循环被阻断或减弱由于TCA和乙醛酸循环被阻断或减弱，草酰乙酸是由丙酮酸或磷酸烯醇式丙酮酸羧化生成的。即由两个CO2固定化反应体系，其中以丙酮酸羧化酶作用下固定化CO2生成草酰乙酸为主生物合成途径四、柠檬酸发酵发酵产率无CO2固定反应的产率理论产率为：192/(180×1.5)=71.1%有CO2固定反应的产率理论产率为：192/180=106.7%正常情况下，柠檬酸、ATP对磷酸果糖激酶有抑制作用，而AMP、无机磷、铵离子对该酶则有激活作用，特别是还能解除柠檬酸、ATP对磷酸果糖激酶的抑制作用铵离子浓度与柠檬酸生成速度有密切关系，细胞内铵离子浓度升高，使磷酸果糖激酶对细胞内积累的大量柠檬酸不敏感锰缺乏时，细胞内铵离子浓度高，氨基酸浓度高（蛋白合成受阻，导致升高）。因此，锰离子效应是通过升高铵离子而减少柠檬酸对磷酸果糖激酶的抑制来实现的代谢调节糖酵解及丙酮酸代谢的调节四、柠檬酸发酵糖酵解的代谢调节四、柠檬酸发酵TCA环的起始酶--柠檬酸合成酶是一种调节酶。但在黑曲霉中，柠檬酸合成酶没有调节作用，这是黑曲霉TCA环的第一个特点顺乌头酸酶失活，阻断TCA环是柠檬酸积累的必要条件，顺乌头酸水合酶需要Fe2＋。顺乌头酸酶、异柠檬酸酶在pH2.0时失活。顺乌头酸水合酶在催化时建立了以下平衡：柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸=90：3：7黑曲霉菌体内α-酮戊二酸脱氢酶缺失或活力很低，它被葡萄糖和NH4＋抑止（第二个特点）代谢调节TCA循环的调节四、柠檬酸发酵TCA循环的调节四、柠檬酸发酵氧是发酵过程（EMP途径和丙酮酸脱氢）生成的NADH2重新氧化时所需标准呼吸链产生ATP积累，侧呼吸