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专题3植物组织培养技术组织培养是指在人工培养基上，离体培养植物的器官、组织、细胞和原生质体，并使其生长、增殖、分化以及再生植株的技术。一、相关理论（1）细胞的分化①概念：在个体发育中，相同细胞的后代在形态、结构、生理功能上发生稳定性差异的过程.②过程：如：受精卵增殖、生长、分化形成组织、器官、系统.③特点：B.稳定性：C.全能性：A.持久性：是一种持久性的变化，它发生在生物体的整个生命过程中,在胚胎期达到最大限度.细胞分化是稳定的，一般是不可逆转的.已分化的细胞，仍具有发育的潜能.⑤原因：基因在特定的时间和空间条件下的选择性表达的结果.④结果：形成不同的细胞和组织（2）细胞的全能性①概念：生物体的细胞具有使后代细胞形成完整个体的潜能的特性.②原理：生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质，都有发育成为完整个体所必需的全部基因.高度特化的动物细胞，从整个细胞来说，全能性受到限制。但它的细胞核仍然保持着全能性，这是因为细胞核内含有该物种遗传性所需要的遗传物质.已分化的植物细胞，仍具有全能性.③实例受精卵生殖细胞体细胞④全能性的比较:二、植物组织培养细胞离体1、必要条件：一定的营养物质、激素和其他外界条件2、原理:细胞的全能性3、植物组织培养过程:离体组织或细胞植物体脱分化细胞分裂素≈生长素愈伤组织芽根细胞分裂素生长素细胞分裂素生长素再分化不需要光?需要光脱分化：由高度分化的植物器官、组织或细胞产生愈伤组织的过程，又称去分化。再分化：脱分化产生的愈伤组织在培养过程中重新分化根或芽等器官的过程愈伤组织:细胞排列疏松而无规则,是高度液泡化的、成无定形状态的薄壁细胞.植物组织培养的过程离体的植物组织或细胞愈伤组织根和芽完整的植物体脱分化再分化4、影响植物组织培养的因素（1）植物材料的选择烟草和胡萝卜的组织培养较为容易枸杞愈伤组织的芽诱导比较难同一植物材料的年龄、保存时间的长短会影响实验结果菊花的组织培养一般选择未开花植株的茎上部新萌生的侧枝（2）离体的植物组织和细胞对营养、环境等条件的要求相对特殊，需配置不同的培养基MS培养基主要成分包括：A、大量元素:N、P、S、K、Ca、Mg等B、微量元素:B、Mn、Cu、Zn、Fe、Mo、I、Co等C、有机物、植物激素MS固体培养基成分及比例讨论：你能说出各种营养物质的作用吗？同专题2中微生物培养基的配方相比，MS培养基的配方有哪些明显的不同？答：微量元素和大量元素提供植物细胞生活所必需的无机盐；蔗糖提供碳源，同时能够维持培养基的渗透压；甘氨酸、维生素等物质主要是为了满足离体植物细胞在正常代谢途径受到一定影响后所产生的特殊营养需求。微生物培养基以有机营养为主。与微生物的培养不同，MS培养基则需提供大量无机营养，无机盐混合物包括植物生长必须的大量元素和微量元素两大类。①常用的植物激素：生长素、细胞分裂素和赤霉素生长素类：2，4－二氯苯氧乙酸（2，4－D）、吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）细胞分裂素类：激动素（KT）、6－苄基嘌呤（6－BA）、玉米素（ZT）赤霉素类：赤霉酸（GA3）（3）、植物激素的影响②生长素和细胞分裂素作用植物中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键性激素。在生长素存在的情况下，细胞分裂素的作用呈现加强的趋势使用顺序实验结果先使用生长素，后使用细胞分裂素有利于细胞分裂，但不利分化先使用细胞分裂素后使用生长素细胞既分裂也分化同时使用分化频率高生长素细胞分裂素：有利于根的分化生长素细胞分裂素：有利于芽的分化，抑制根的分化生长素细胞分裂素：＝促进愈伤组织生长③生长素和细胞分裂素同时使用，用量的比例对植物细胞发育方向的影响pH、温度、光照pH控制在5.8左右，温度控制在18－22。C,每日用日光灯照射12h.(1)、培育无病毒植株(2)、培养紫草愈伤组织,提取紫草素（治疗烫伤和割伤的药物以及染料和化妆品的原料）(4)、基因工程中亦需用到植物组织培养的方法5、植物组织培养的应用：(3)、诱导离体的植物组织形成具有生根发芽能力的胚状结构，包裹上人造种皮，制成人工种子，可以解决有些作物品种繁殖能力差，结子困难或发芽率低等问题.二、实验操作（一）制备MS固体培养基MS培养基包括20多种营养成分，实验室一般使用4。C保存配制好的培养基母液来制备.1、配置各种母液①无机物中大量元素浓缩10倍，微量元素浓缩100倍，常温保存.②激素类、维生素类以及用量较小的有机物一般可按1mg/ml的质量浓度单独配制成母液.③用母液配制培养基时，需要根据各种母液的浓缩倍数，计算用量.2、配置培养基分装到锥形瓶中，每瓶分装50ml或100ml.①配制培养液②调PH③培养基的分装注意：由于菊花的茎段的组织培养比较容易，因此不必添加植物激素.3、灭菌分装好的培养基连同其他器械一起进行高压蒸汽灭菌.1、选材：菊花茎段，取生长旺盛的嫩枝.（二）外植体消毒2、消毒①流水冲洗菊花茎段用流水冲洗后可少许洗衣粉，用软刷轻轻刷洗，刷洗后在流水下冲洗20min左右.②酒精处理用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入体积分数为70％的酒精中摇动2－3次，持续6－7s，立即将外植体取出，在无菌水中清洗.③消毒液处理取出后用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入质量分数为0.1％的氯化汞溶液中1－2min，取出后在无菌水中至少清洗3次，漂净消毒液.（三）接种污染的主要来源是空气中的细菌和孢子，接种室消毒是至关重要的。用70％的酒精喷雾使空气消毒，酒精或新洁尔灭搽洗工作台并用紫外线照射20分钟1、接种室消毒2、无菌操作要求操作要在酒精灯火焰旁完成，每次使用器械后，都需要用火焰灼烧灭菌，接种后立即盖好瓶盖。3、材料的切取和接种4、接种注意事项①每接种一块外植体前，镊子需放入体积分数为75％的酒精溶液中消毒一次，然后在酒精灯火焰上烧一遍，冷却后再接种.②外植体在培养基中要分布均匀，放置外植体数量根据锥形瓶的大小确定，一般胡萝卜3－4块，菊的茎或叶6－8块，也不要太少，以充分利用培养基中的营养成分和光照条件.③插入时应注意方向，不要倒插。茎段、茎尖基部插入培养基利于吸收水分和养分.思考：你打算做几组重复？你打算设置对照实验吗？答：每种材料或配方至少要做一组以上的重复。设置对照实验可以取用一个经过灭菌的装有培养基的锥形瓶，与接种操作后的锥形瓶一同培养，用以说明培养基制作合格，没有被杂菌污染。（四）培养1、愈伤组织的培养从接种外植体到出现愈伤组织需经过2周时间。2周之内可以看到外植体上逐渐长出乳白色或黄白色的瘤状愈伤组织。首次培养愈伤组织时，恒温箱的门应该关闭不必见光，因为在无光条件下愈伤组织长的更快。2周后，培养基成分接近耗尽，必须更换培养基，进行继代培养.继代培养所用的培养基与培养愈伤组织的相同，在严格的无菌条件下，将愈伤组织连同原来的外植体一起移到新培养基上。愈伤组织的继代培养一代为20d。如果延长时间，培养基中营养物质减少，外植体会分泌有毒物质，造成自身中毒。如果愈伤组织长到直径为1－1.5cm时，就可以进行试管苗培养，否则还需进行第二代继代培养.2、愈伤组织的继代培养在愈伤组织继代培养期间，将恒温箱的门打开，让愈伤组织见光，愈伤组织见光后颜色可以转为绿色.3、试管苗的培养当愈伤组织长到一定大小后，可以更换培养基，进行试管苗的见光培养.（五）移栽移栽生根的菊花试管苗之前，应先打开培养瓶的封口膜，让试管苗在培养间生长几日.1、打开封口膜2、清洗转移用流水清洗根部的培养基，将幼苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境下生活一段时间.（六）栽培3、移栽珍珠岩：固体基质型，含水量高、蓄水性强、透性好，适合栽培.幼苗长壮后，移栽到土壤中.幼苗移栽后，每天观察并记录幼苗的生长情况，适时浇水、施肥，直至开花.JLSSYBYH知识回顾•单倍体育种的过程？花药离体培养（N）单倍体植株（N）秋水仙素处理，使染色体翻倍植株（2N）特点：1明显缩短育种年限2后代植株都为纯合子。正常植株（2N）被子植物的有性生殖是在花里进行的，雌蕊和雄蕊是进行有性生殖的主要部分。雌蕊雄蕊花丝花药：囊状结构，内有很多花粉雄蕊一、被子植物的花粉发育花丝花药：囊状结构，内有很多花粉花粉是由花粉母细胞（即小孢子母细胞）经过减数分裂而形成的，因此，花粉是单倍体的生殖细胞。花粉的发育要经历：四分体时期、单核期、双核期等阶段。（一）被子植物的花粉发育雄蕊花粉母细胞（小孢子母细胞）4个小孢子(小孢子四分体时期）减数分裂小孢子四分体1个小孢子花粉粒（双核期）有丝分裂单核双核营养细胞核营养细胞生殖细胞核2个精子花粉是单倍体的生殖细胞有丝分裂花粉粒小孢子母细胞小孢子花粉囊花药花粉粒（双核期）成熟花粉8个精子小孢子母细胞（）时期单核（）期双核期（）细胞核（）细胞核（）细胞（）细胞（）个精子（）分裂（）分裂单核（）期（）分裂减数小孢子四分体中边有丝生殖生殖花粉管营养有丝22NNNNNNNNN注意：①“此”四分体非“彼”四分体：“此”：是指被子植物花粉发育过程中，四个小孢子连在一起；“彼”：是指减数分裂过程中同源染色体两两联会后，每个四分体含有四条姐妹染色单体。②正确认识营养细胞和精子的关系：精子就处在营养细胞的原生质中，营养细胞为花粉管的形成提供营养物质。（二）产生花粉植株的两种途径花药中的花粉丛芽再分化生根植物体脱分化移栽诱导愈伤组织花粉分化生根移栽诱导脱分化丛芽植物体（二）产生花粉植株的两种途径胚状体①②移栽花药中的花粉胚状体脱分化愈伤组织花药中的花粉脱分化分化丛芽再分化丛芽诱导生根体细胞胚（胚状体）：在组织培养过程中，某些细胞在形态上转变为与合子发育成的胚非常相似的结构，发育过程亦与合子胚类似，胚芽，胚轴，胚根等结构完整，就像一颗种子原因：培养基中的激素种类及浓度配比（二）产生花粉植株的两种途径（一）被子植物的花粉发育减数分裂细胞生长小孢子母细胞或花粉母细胞2N4个小孢子N四分体时期1个小孢子N单核居中期单核靠边期N单核花粉粒有丝分裂有丝分裂精子（花粉或花粉细胞）营养细胞核营养细胞生殖细胞思考：（1）假如一种生物体细胞有20条染色体，则小孢子母细胞、小孢子、营养细胞、精子中各有多少条染色体？小孢子母细胞：20小孢子：10营养细胞：10精子：10神奇的人工种子:通过胚状体途径形成小植株烟草花药培养胚状体发育途径能否成功：1、材料的选择2、培养基的组成（MS培养基+不同比例的植物生长调节激素）•此外，植株生长条件、材料低温预处理、接种密度等(三)、影响花药培养的主要因素（一）材料选取2、通过镜检来确定是否处于适宜的发育期。方法：醋酸洋红法(将染色体染成红色)—常用方法焙花青-铬矾法(花粉细胞核染成蓝黑色)。1、从花药看：从花粉看：从花蕾看：花药（载玻片上）→1%的醋酸洋红1滴→用镊柄将花药捣碎，盖上盖玻片→镜检（花粉粒的细胞核被染成红色）花药（在卡诺氏固定液中处理20min）→取出，置于载玻片上→焙花青－铬矾溶液染色→盖上盖玻片→镜检（花粉粒的细胞核被染成蓝黑色）月季的初花期单核靠边期完全未开放的（二）材料的消毒5、冲洗3～5次花药的外面有花萼、花瓣保护，通常处于无菌状态1、花蕾用浸泡30秒2、清洗3、吸干花蕾表面的水分4、放入溶液中2～4分钟（质量分数为1%的次氯酸钙溶液或饱和漂白粉溶液）体积分数为70%的酒精无菌水质量分数为0.1%的氯化汞无菌水无菌吸水纸思考：月季花蕾的消毒与菊花外植体的消毒相比较，二者有何不同？在酒精消毒前，花药不需要预先用流水冲洗、洗衣粉洗涤和软刷刷洗为什么花瓣松动会给材料的消毒带来困难？答：花瓣松动后，微生物就可能侵入到花药，给材料的消毒带来困难。（三）接种和培养1灭菌后花蕾，要在下除去萼片和花瓣，并立即将花药接种到培养基上。3通常每瓶接种花药，温度控制在左右，。幼小植株形成后才。2在剥离花药时，要尽量（否则接种后，容易从受伤部位产生二倍体的愈伤组织），同时还要彻底，因为与花丝相连的花药不利于愈伤组织或胚状体的形成。一般经过20-30天培养后，会发现花药开裂，长出愈伤组织或释放出胚状体。将愈伤组织及时转移到分化培养基