Marfey法与质谱联用技术

Marfey法与质谱联用技术及其应用目录前言LC/MS决定氨基酸绝对构型的原理1.Marfey法分离机制的探讨2.Marfey法与质谱的联用3.衍生化过程小结应用举例前言常见的确定化合物立体结构的方法有如下几种：（1）化学转变法；（2）旋光比较法；（3）旋光谱（ORD）和圆二色光谱（CD）；（4）单晶X－射线衍射法；（5）核磁共振法；（6）Marfey法与质谱联用。目前酶法和CD法已用于决定氨基酸的绝对构型，但这些都是直接的方法，确定一种对映异构体时需要相对大量的样品及较长的分析时间，因为在分析之前必须将每种氨基酸分离出来。另一方面，色谱方法例如GC和HPLC已经代替这些直接方法广泛使用，氨基酸的绝对构型是通过衍生化后，在非对映环境下比较对照品氨基酸的保留时间来决定的，这些色谱学方法的优点在于分析所用的样品用量少、节省时间，并且可以同时分析十种以上氨基酸。色谱学方法的缺点在于需要对照品氨基酸，对于含有非常见氨基酸的肽类是不适用的。1984年，Marfey发明了一种用HPLC来决定氨基酸绝对构型的方法，该方法基于这样一个原理：通过手性试剂进行衍生化，将D-和L-氨基酸用HPLC分离成对映异构体。于是引入手性试剂FDAA（（1-氟-2，4-二硝基苯基-5）-L-丙氨酰胺，(1-Fluoro-2，4-dinitrophenyl-5)-L-alaninamide），被命名为Marfey试剂。NO2O2NFNHNH2OH3C氨基酸与Marfey试剂反应所得衍生物用常用的HPLC进行分离，并在UV340nm处进行检测。L-氨基酸衍生物常常先于对应的D-氨基酸衍生物从柱上洗脱下来，在梯度洗脱的条件下，该方法能正确地确定氨基酸的绝对构型，并且具有很高的灵敏度。因此，Marfey法广泛用于肽类化合物的结构确证，证实肽类合成中的外消旋作用。但是，在没有标准品的情况下，将该方法用来分析含非常见氨基酸的肽类还是很困难的。常见的Marfey试剂如下所示：L-FDAA:(1-氟-2，4-二硝基苯基-5)-L-丙氨酰胺L-FDVA:……………..……………..-L-缬氨酰胺L-FDPA:……………..……………..-L-苯丙氨酰胺L-FDIA:……………..……………..-L-异亮氨酰胺L-FDLA:……………..……………..-L-亮氨酰胺D-FDAA:……………..……………..-D-丙氨酰胺其结构如下：为了将Marfey法与质谱联用的方法建立起来，必须解决如下三个问题：（1）解释Marfey法用作色谱技术的分离机制，及其局限。（2）如何在没有标准品的情况下有效地将Marfey法和质谱联系起来，来检测和确定目标氨基酸。（3）如何从一个肽类样品的L-或D-氨基酸中获得相应的对映异构体LC/MS决定氨基酸绝对构型的原理Marfey法分离机制的探讨Marfey法与质谱的联用衍生化过程Marfey法分离机制的探讨下图是用LC/MS来决定肽中氨基酸绝对构型的全过程，命名作“高级Marfey法”如图所示，肽水解所得氨基酸的混合物分成两部分（sample1和sample2)。Sample1与FDAA衍生化后，直接用LC/MS分析，通过衍生物的保留时间和质谱得以确定为何种氨基酸，如果检测到有非常见氨基酸，其平面结构可以通过其衍生物的质谱得以阐明。Sample2主要用来决定非常见氨基酸的绝对构型。由于天然存在的肽类往往由D-型或L-型氨基酸组成，在色谱图上，每个氨基酸给出一个峰，其绝对构型无法在这一步决定。因此，为了得到其对映体，Sample2中的氨基酸必须在适当的条件下进行外消旋化。但是，与FDAA衍生化及外消旋化后所得的色谱图变得复杂了，很难发现一对差向异构体。在该法中使用了质量色谱。每对差向异构体有两个峰，在以目标氨基酸衍生物分子离子碎片的m/z值为检测指标的质量色谱图上可以选择到这两个峰。然后，通过比较Sample1中原峰的保留时间和Sample2中新产生峰的保留时间，就可以根据Marfey法中的洗脱规律来判定绝对构型了。本法将可购得的氨基酸分为四类：中性氨基酸、含-OH和酸性氨基酸、碱性和N-甲基氨基酸，在同样的条件下研究其分离行为。FDAA主要与氨基酸上未取代的氨基、酚羟基、巯基包括N-甲基反应。每种氨基酸的非对映异构体对都是通过其D-异构体的保留时间(tRD)和L-异构体的保留时间(tRL)的差值(△t)来判定的。当△t值大于±1.0时，每组非对映异构体对完全被分离为两个非对映异构体。左边的表格显示了四种氨基酸的两种异构体保留时间及其差异。对中性氨基酸已经获得很好的判定，所有L-型非对映异构体都先于D-型被洗脱下来。随着烃基侧链增长，判定效率提高，保留时间也会更长（亚氨基酸和脯氨酸除外）。酪氨酸得到两衍生物，因为FDAA会引入到－NH2上，也会引入到酚－OH上。酸性或含－OH氨基酸的判定相对于中性氨基酸要难一些。因为其保留时间变短。侧链含有酰氨基的天冬酰胺、谷氨酰胺比天冬氨酸和谷氨酸更难判定。在含－OH的氨基酸中，丝氨酸显示出最差的判定能力，但是高丝氨酸的判定稍好些，氧甲基丝氨酸显示了与丙氨酸相似的判定能力。另外，β-OH天冬氨酸的两个非对映异构体显示相反的洗脱规律，而且它们的保留时间极短对于碱性氨基酸，赖氨酸和鸟氨酸有三种衍生物：单α-取代、单ω-取代和二取代衍生物；组氨酸有两种衍生物，单α-取代和双取代衍生物。它们的单α-取代和双取代可被判定，而单ω-取代衍生物无法判定，表明α-氨基的衍生化对于判定是必要的。但是碱性氨基酸的洗脱规律取决于所选流动相的PH大小，可能为LD的常规顺序，也可能相反。赖氨酸和组氨酸的双衍生物显示了正常的洗脱规律，而鸟氨酸却显示相反的顺序，尽管它们有较长的保留时间。购得的N-甲基氨基酸，例如丙氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和天冬氨酸的N-甲基衍生物，尽管其保留时间长于各母氨基酸，但其判定能力要低于母氨基酸。尤其是N-甲基丙氨酸无法判定，N-甲基天冬氨酸以相反顺序被洗脱出。综上，FDAA的L-氨基酸衍生物并不总是先于对应的D-氨基酸衍生物被洗脱下来。因此，阐明不了分离机制，Marfey法就不能用于非常见氨基酸的判定。此外，实验结果表明以下两点对于洗脱顺序至关重要：①氨基酸的疏水性；②在分离过程中FDAA衍生物的构象。使用UV（二极管阵列检测器）和NMR方法来解决该问题（因为，它们易受构象的影响）。如上图所示，在340和414nm处有特征性最大吸收，是由二硝基苯上的硝基与氨基酸及L-丙氨酰胺的－NH2之间的氢键所形成的发色团产生的；而且，D-缬氨酸衍生物的UV谱与其L-型衍生物的相符。所有被测氨基酸的衍生物显示非常相似的UV谱，脯氨酸和N-甲基氨基酸除外。尤其是给出相反洗脱顺序的双取代衍生物及D-和L-鸟氨酸显示了特征的UV谱，其吸收波长从340nm蓝移到320nm。这些结果表明，稳定的构象，包括分子内氢键，形成了一个像蒽一样的三环系统的平面分子（如下图所示）。综上，对于L-和D-氨基酸衍生物的判定基于其疏水性的差异，源于氨基酸和L-丙氨酰胺α－碳上两个疏水性取代基的顺／反位置。于是，顺式排列的FDAA衍生物与ODS作用更强烈，比反式排列的衍生物有更长的保留时间。对于大多数氨基酸来说，由于氨基酸侧链取代基的疏水性往往小于－COOH，D-氨基酸衍生物具有顺式结构，因此在Marfey法中L-氨基酸衍生物往往先于D-氨基酸衍生物出柱。另有文献证明，氢键的形成对结构的判定也是很有用的。L-缬氨酸的FDAA衍生物的NOE实验显示，缬氨酸的α-质子及L-丙氨酰胺的α-质子与苯环的H－6之间存在着强烈的NOE，如上图所示；而H－6与缬氨酸的异丙基和L-丙氨酰胺的甲基之间没有NOE。另外，D-缬氨酸的FDAA衍生物与L-衍生物几乎显示相同的NMR行为。这些结果表明，两α-质子都在空间上位于苯环H－6的附近，在L-和D-缬氨酸衍生物中均如此。由此，缬氨酸和丙氨酰胺的除－NH2以外的其它取代基均位于垂直于二硝基苯平面的位置上，在溶液中是稳定的，也是占优势的。如图所示：D-缬氨酸的FDAA衍生物为顺（Z）－式排列，两个疏水性取代基在同侧；L-缬氨酸的FDAA衍生物为反（E）－式排列，两个疏水性基团在异侧。为了确定α－COOH是否对结构的判定必不可少，文章对氨基酸甲酯和脱－COOH的氨基化合物的FDAA衍生物进行了研究。所测氨基酸甲酯及氨基化合物的判定结果如上表所示，它们的UV谱与母氨基酸的完全相同，保留时间比母氨基酸长，氨基酸甲酯的判定能力下降。另外，丙氨酸甲酯的FDAA衍生物未得判定，丝氨酸甲酯衍生物显示相反的洗脱顺序。氨基化合物的保留时间和判定能力几乎与其母氨基酸相同。结果表明，α－COOH对于氨基酸的判定并不总是必须的。前已述，与中性氨基酸相比，酸性和含－OH氨基酸及氨基酸甲酯的判定能力差，尤其是β-OH天冬氨酸、丝氨酸甲酯,给出了相反的洗脱顺序（DL）。这些数据进一步证实一个氨基酸的FDAA衍生物在氨基酸和L-丙氨酰胺部分有两个处于反式的疏水性取代基，要比其相应的顺式氨基酸衍生物先流出反相柱。以上结果也可如下证实，考察用FDPA、FDVA、FDIA、FDLA和D-FDAA的氨基酸衍生物的分离行为，如下表所示：如所预期，随着烃基侧链增长，其保留时间也增长，判定能力也增强；而D-FDAA的氨基酸衍生物则显示了相反的洗脱顺序。本机理有一缺陷，即明确地评价两个功能基团的疏水性是有困难的，可以考虑用氨基酸衍生物保留时间的顺序来解释洗脱顺序。因为在氨基酸中α－COOH是一个常见的功能基团，而一个氨基酸的FDAA衍生物的疏水性也决定于该氨基酸的侧链，因此，DL-氨基酸的tR和洗脱顺序间的关系已如Table1所示。如Figure4所示，具有常规洗脱顺序（LD）的D-和L-氨基酸衍生物的tR要比侧链疏水性与α－COOH相当的氨基酸衍生物的长，例如丝氨酸和天冬氨酸。另一方面，具有相反洗脱顺序的氨基酸衍生物具有相对较短的平均保留时间。于是，目标氨基酸的洗脱顺序可以用L-和D-氨基酸衍生物的平均保留时间进行解释。DL-丝氨酸和天冬酰胺衍生物可被看作临界样品，它们的平均保留时间位于洗脱顺序的临界点上。然而，鸟氨酸的二取代衍生物表现出非常有趣的分离行为，它们的洗脱顺序是相反的，尽管它们有相对较长的保留时间（27.3min），如Figure4所示。对这种分离行为的研究正在进行之中。至此，第一个问题已基本得到解决。由于氨基酸与L-FDAA所得衍生物的热不稳定性和低疏水性，致使它们对LC/MS分析的敏感性很差。于是，选择电喷雾离子化和frit-FAB作为接口，并发展用(1-氟-2，4-二硝基苯基-5)-L-亮氨酰胺，即L-FDLA取代FDAA:(1-氟-2，4-二硝基苯基-5)-L-丙氨酰胺，作为衍生化试剂，以便将Marfey法和质谱联系起来。Marfey法与质谱的联用在Marfey法中，氨基酸的L-FDAA衍生物由常规的反相HPLC分离并在UV340nm处检测；在本法中，UV检测器被换成质谱仪，即氨基酸衍生物经LC/MS分析。为了顺利地将传统的HPLC条件改为适合LC/MS分析的LC条件，必须解决如下两个问题：（1）将从HPLC洗脱出来的液体注入质谱仪时，其体积应大大减小，因为ESI和frit-FAB是最终被作为一种接口来使用的。（2）HPLC流动相中的非挥发性缓冲液应用挥发性缓冲液代替。解决方法：（1）应用半微量柱（150×2.1mmI.d,），本法用该柱给予L-和D-氨基酸衍生物以足够的分离度。若为frit-FABLC/MS溶液流速应进一步减小至5μl/min。（2）使用TFA或醋酸铵缓冲液（PH＝3）作为流动相，与使用磷酸缓冲溶剂系统有几乎相同的分离度。尝试了4种用于分析氨基酸L-FDAA衍生物的LC/MS接口，即ESI、大气压化学离子化（APCI）、TSP、和frit-FAB。极性氨基酸衍生物不能用TSP和APCI作为接口。尽管任何氨基酸都可以用ESI和frit-FAB接口，但它们的灵敏度特别低，这可能是由于氨基酸的L-FDAA衍生物的热不稳定性和低疏