沙门氏菌检测

沙门氏菌检测1设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：1.1冰箱：2℃～5℃。1.2恒温培养箱：36℃±1℃，42℃±1℃。1.3均质器。1.4振荡器。1.5电子天平：感量0.1g。1.6无菌锥形瓶:容量500ml，250ml。1.7无菌吸管：1ml（具0.01ml刻度）、10ml（具0.1ml刻度）或微量移液器及吸头。1.8无菌培养皿：直径90mm。1.9无菌试管：3mm×50mm、10mm×75mm。1.10无菌毛细管。1.11pH计或pH比色管或精密pH试纸。1.12全自动微生物生化鉴定系统。2培养基和试剂2.1缓冲蛋白胨水（BPW）：见附录中1。2.2四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液：见附录中2。2.3亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液：见附录中3。2.4亚硫酸铋（BS）琼脂：见附录中4。2.5HE琼脂：见附录中5。2.6木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂：见附录中6。2.7沙门氏菌属显色培养基。2.8三糖铁（TSI）琼脂：见附录中7。2.9蛋白胨水、靛基质试剂：见附录中8。2.10尿素琼脂（pH7.2）：见附录中9。2.11氰化钾（KCN）培养基：见附录中10。2.12赖氨酸脱羧酶试验培养基：见附录中11。2.13糖发酵管：见附录中12。2.14邻硝基酚β-D半乳糖苷（ONPG）培养基：见附录中13。2.15半固体琼脂：见附录中14。2.16丙二酸钠培养基：见附录中15。2.17沙门氏菌O和H诊断血清。2.18生化鉴定试剂盒。3操作方法3.1试验前准备3.1.1将供试品及所有已灭菌的平皿、锥形瓶、匀浆杯、试管、量筒、吸管（1ml、10ml）、稀释剂等移至操作室内。准备好足够用量，避免操作中出入操作间。3.1.2开启无菌室紫外杀菌灯和洁净工作台的空气过滤装置30min。3.1.3操作人员用肥皂洗手，关闭紫外杀菌灯，进入缓冲间，换工作鞋，用消毒液洗手或用乙醇棉球擦手，穿戴好无菌衣、帽、口罩、手套等。3.1.4操作前先用乙醇棉球擦手、工作台面，再用乙醇棉球擦拭供试品瓶、盒、袋等的开口处周围，待干后用灭菌剪刀或镊子将供试品启封。3.2前增菌称取25g（ml）样品放入盛有225mlBPW的无菌均质杯中，以8000r/min～10000r/min均质1min～2min，或置于盛有225mlBPW的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min。若样品为液态，不需要均质，振荡混匀。如需测定pH值，用1mol/ml无菌NaOH或HCl调pH至6.8±0.2。无菌操作将样品转至500ml锥形瓶中，如使用均质袋，可直接进行培养，于36℃±1℃培养8h～18h。如为冷冻产品,应在45℃以下不超过15min,或2℃～5℃不超过18h解冻。3.3增菌轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1ml，转种于10mlTTB内，于42℃±1℃培养18h～24h。同时，另取1ml，转种于10mlSC内，于36℃±1℃培养18h～24h。3.4分离分别用接种环取增菌液1环，划线接种于一个BS琼脂平板和一个XLD琼脂平板（或HE琼脂平板或沙门氏菌属显色培养基平板）。于36℃±1℃分别培养18h～24h（XLD琼脂平板、HE琼脂平板、沙门氏菌属显色培养基平板）或40h～48h（BS琼脂平板），观察各个平板上生长的菌落。各个平板上的菌落特征见表1。表1沙门氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征选择性琼脂平板沙门氏菌BS琼脂菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰绿色的菌落，周围培养基不变。HE琼脂蓝绿色或蓝色，多数菌落中心黑色或几乎全黑色；有些菌株为黄色，中心黑色或几乎全黑色。XLD琼脂菌落呈粉红色，带或不带黑色中心，有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心，或呈现全部黑色的菌落；有些菌株为黄色菌落，带或不带黑色中心。沙门氏菌属显色培养基按照显色培养基的说明进行判定。3.5生化试验3.5.1自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落，接种三糖铁琼脂，先在斜面划线，再于底层穿刺；接种针不要灭菌,直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于36℃±1℃培养18h～24h，必要时可延长至48h。在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内，沙门氏菌属的反应结果见表2。表2沙门氏菌属在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果三糖铁琼脂赖氨酸脱羧酶试验培养基初步判断斜面底层产气硫化氢KA＋(－)＋(－)＋可疑沙门氏菌属KA＋(－)＋(－)－可疑沙门氏菌属AA＋(－)＋(－)＋可疑沙门氏菌属AA＋/－＋/－－非沙门氏菌KK＋/－＋/－＋/－非沙门氏菌注：K：产碱，A：产酸，＋：阳性，－：阴性；＋(－)多数阳性，少数阴性；＋/－：阳性或阴性。3.5.2接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时,可直接接种蛋白胨水（供做靛基质试验）、尿素琼脂（pH7.2）、氰化钾（KCN）培养基，也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑取可疑菌落接种。于36℃±1℃培养18h～24h，必要时可延长至48h，按表3判定结果。将已挑菌落的平板储存于2℃～5℃或室温至少保留24h，以备必要时复查。表3沙门氏菌属生化反应初步鉴别表反应序号硫化氢（H2S）靛基质pH7.2尿素氰化钾（KCN）赖氨酸脱羧酶A1＋－－－＋A2＋＋－－＋A3－－－－＋/－注：＋：阳性，－：阴性，＋/－：阳性或阴性。3.5.2.1反应序号A1：典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCN和赖氨酸脱羧酶3项中有1项异常，按表4可判定为沙门氏菌。如有2项异常为非沙门氏菌。表4沙门氏菌属生化反应初步鉴别表pH7.2尿素氰化钾（KCN）赖氨酸脱羧酶判定结果－－－甲型副伤寒沙门氏菌（要求血清学鉴定结果）－＋＋沙门氏菌IV或V（要求符合本群生化特性）＋－＋沙门氏菌个别变体（要求血清学鉴定结果）注：＋：阳性，－：阴性。3.5.2.2反应序号A2：补做甘露醇和山梨醇试验，沙门氏菌靛基质阳性变体两项试验结果均为阳性，但需要结合血清学鉴定结果进行判定。3.5.2.3反应序号A3：补做ONPG。ONPG阴性为沙门氏菌，同时赖氨酸脱羧酶阳性。甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。3.5.2.4必要时按表5进行沙门氏菌生化群的鉴别。表5沙门氏菌属各生化群的鉴别项目IIIIIIIVVVI卫矛醇＋＋－－＋－山梨醇＋＋＋＋＋－水杨苷－－－＋－－ONPG－－＋－＋－丙二酸盐－＋＋－－－KCN－－－＋＋－注：＋：阳性，－：阴性。3.5.3如选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统，可根据3.5.1的初步判断结果，从营养琼脂平板上挑取可疑菌落，用生理盐水制备成浊度适当的菌悬液，使用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统进行鉴定。3.6血清学鉴定3.6.1抗原的准备一般采用1.2％～1.5％琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。O血清不凝集时，将菌株接种在琼脂量较高的（如2％～3％）培养基上再检查；如果是由于Vi抗原的存在而阻止了O凝集反应时，可挑取菌苔于1ml生理盐水中做成浓菌液，于酒精灯火焰上煮沸后再检查。H抗原发育不良时，将菌株接种在0.55％～0.65％半固体琼脂平板的中央，俟菌落蔓延生长时，在其边缘部分取菌检查；或将菌株通过装有0.3％～0.4％半固体琼脂的小玻管1次～2次，自远端取菌培养后再检查。3.6.2多价菌体抗原（O）鉴定在玻片上划出2个约1cm×2cm的区域，挑取1环待测菌，各放1/2环于玻片上的每一区域上部，在其中一个区域下部加1滴多价菌体（O）抗血清，在另一区域下部加入1滴生理盐水，作为对照。再用无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌落研成乳状液。将玻片倾斜摇动混合1min，并对着黑暗背景进行观察，任何程度的凝集现象皆为阳性反应。3.6.3多价鞭毛抗原（H）鉴定同3.6.2。3.7结果与报告综合以上生化试验和血清学鉴定的结果，报告25g（ml）样品中检出或未检出沙门氏菌。附录培养基和试剂1缓冲蛋白胨水（BPW）1.1成分蛋白胨10.0g氯化钠5.0g磷酸氢二钠（含12个结晶水）9.0g磷酸二氢钾1.5g蒸馏水1000mlpH7.2±0.21.2制法将各成分加入蒸馏水中，搅混均匀，静置约10min，煮沸溶解，调节pH，高压灭菌121℃，15min。2四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液2.1基础液蛋白胨10.0g牛肉膏5.0g氯化钠3.0g碳酸钙45.0g蒸馏水1000mlpH7.0±0.2除碳酸钙外，将各成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，再加入碳酸钙，调节pH，高压灭菌121℃，20min。2.2硫代硫酸钠溶液硫代硫酸钠（含5个结晶水）50.0g蒸馏水加至100ml高压灭菌121℃，20min。2.3碘溶液碘片20.0g碘化钾25.0g蒸馏水加至100ml将碘化钾充分溶解于少量的蒸馏水中，再投入碘片，振摇玻瓶至碘片全部溶解为止，然后加蒸馏水至规定的总量，贮存于棕色瓶内，塞紧瓶盖备用。2.40.5％煌绿水溶液煌绿0.5g蒸馏水100ml溶解后，存放暗处，不少于1d，使其自然灭菌。2.5牛胆盐溶液牛胆盐10.0g蒸馏水100ml加热煮沸至完全溶解，高压灭菌121℃，20min。2.6制法基础液900ml硫代硫酸钠溶液100ml碘溶液20.0ml煌绿水溶液2.0ml牛胆盐溶液50.0ml临用前，按上列顺序，以无菌操作依次加入基础液中，每加入一种成分，均应摇匀后再加入另一种成分。3亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液3.1成分蛋白胨5.0g乳糖4.0g磷酸氢二钠10.0g亚硒酸氢钠4.0gL-胱氨酸0.01g蒸馏水1000mlpH7.0±0.23.2制法除亚硒酸氢钠和L-胱氨酸外，将各成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，冷至55℃以下，以无菌操作加入亚硒酸氢钠和1g/LL-胱氨酸溶液10ml（称取0.1gL-胱氨酸，加1mol/L氢氧化钠溶液15ml，使溶解，再加无菌蒸馏水至100ml即成，如为DL-胱氨酸，用量应加倍）。摇匀，调节pH。4亚硫酸铋（BS）琼脂4.1成分蛋白胨10.0g牛肉膏5.0g葡萄糖5.0g硫酸亚铁0.3g磷酸氢二钠4.0g煌绿0.025g或5.0g/L水溶液5.0ml柠檬酸铋铵2.0g亚硫酸钠6.0g琼脂18.0g～20g蒸馏水1000mlpH7.5±0.24.2制法将前三种成分加入300ml蒸馏水（制作基础液），硫酸亚铁和磷酸氢二钠分别加入20ml和30ml蒸馏水中，柠檬酸铋铵和亚硫酸钠分别加入另一20ml和30ml蒸馏水中，琼脂加入600ml蒸馏水中。然后分别搅拌均匀，煮沸溶解。冷至80℃左右时，先将硫酸亚铁和磷酸氢二钠混匀，倒入基础液中，混匀。将柠檬酸铋铵和亚硫酸钠混匀，倒入基础液中，再混匀。调节pH，随即倾入琼脂液中，混合均匀，冷至50℃～55℃。加入煌绿溶液，充分混匀后立即倾注平皿。注：本培养基不需要高压灭菌，在制备过程中不宜过分加热，避免降低其选择性，贮于室温暗处，超过48h会降低其选择性，本培养基宜于当天制备，第二天使用。5HE琼脂（HektoenEntericAgar）5.1成分蛋白胨12.0g牛肉膏3.0g乳糖12.0g蔗糖12.0g水杨素2.0g胆盐20.0g氯化钠5.0g琼脂18.0g～20.0g蒸馏水1000ml0.4％溴麝香草酚蓝溶液16.0mlAndrade指示剂20.0ml甲液20.0ml乙液20.0mlpH7.5±0.25.2制法将前面七种成分溶解于400ml蒸馏水内作为基础液;将琼脂加入于600ml蒸馏水内。然后分别搅拌均匀，煮沸溶解。加入甲液和乙液于基础液内,调节pH。再加入指示剂,并与琼脂液合并,待冷至50℃～55℃倾注平皿。注:①本培养基不需要高压灭菌，在制备过程中不宜过分加热，避免降低其选择性。②甲液的配制硫代硫酸钠34.0g柠檬酸铁铵4.0g蒸馏水100ml③乙液的配制去氧胆酸钠10.0g蒸馏水100ml④Andrade指示剂酸性复红0.5g1mol/L氢氧化钠溶液16.0ml蒸馏水100ml将复红溶解于蒸馏水中,加入氢氧化钠溶液。数小时后如复红褪色不全,再加氢氧化钠溶液1ml～2ml。6木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂6.1成分酵母膏3.