选修三的教材处理及教学资源开发概要

选修三的教材处理及教学资源开发长春第八中学王丽梅(一)易混概念基因探针基因诊断基因敲除DNA分子杂交技术抗原—抗体杂交技术基因探针•即核酸探针，是一段带有检测标记，且顺序已知的，与目的基因互补的核酸序列(DNA或RNA)。根据杂交原理，作为探针的核酸序列至少必须具备以下两个条件：•①应是单链。若为双链，必须先行变性处理。•②应带有容易被检测的标记。基因诊断又称DNA诊断或分子诊断。通过分子生物学和分子遗传学技术，直接检测出分子结构水平和表达水平是否异常，从而对疾病做出判断。进行基因检测有两个必要条件：•一是必需的特异的DNA探针•二是必需的基因组DNA。基因敲除•是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理。用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。DNA分子杂交技术•互补的核苷酸序列通过Walson-Crick碱基配对形成稳定的杂合双链分子DNA分子的过程称为杂交。杂交过程是高度特异性的,可以根据所使用的探针已知序列进行特异性的靶序列检测。抗原-抗体杂交技术•Western杂交──蛋白质分子（抗原—抗体）之间的杂交。它是检测目的基因是否表达出蛋白质的一种方法。具体做法•第一步：将目的基因在大肠杆菌中表达出蛋白质•第二步：将表达出的蛋白质注射动物进行免疫，产生相应的抗体，并提取出抗体（一抗）•第三步：从转基因生物中提取蛋白质，走凝胶电泳•第四步：将凝胶中的蛋白转移到硝酸纤维素膜上•第五步：将抗体（一抗）与硝酸纤维素膜上的蛋白杂交，这时抗体（一抗）与目的基因表达的蛋白（抗原）会特异结合。•由于这种抗原—抗体的结合显示不出条带，所以加入一种称为二抗的抗体，它可以与一抗结合。二抗抗体上带有特殊的标记。如果目的基因表达出了蛋白质，则结果为阳性。(二)疑难问题限制性核酸内切酶能识别RNA序列吗？限制性核酸内切酶是能够识别和切割DNA分子内一小段特殊核苷酸序列的酶。不同限制酶处理获得的不同黏性末端也可形成重组DNA分子吗？限制酶产生的末端的连接有三种情况：①匹配末端。用同一种酶酶切产生的带相同突出端的两个片段用不同的酶酶切但带有相同突出端的两个片段，如用BamHⅠ及BglⅡ酶切相同的突出端都可以匹配，并在连接酶作用下连接。②平末端。平末端可以直接连接，但连接效率比黏性末端低。③不匹配黏端。不配对黏端的连接可采用两种方法：A.用S1酶切除突出的核苷酸，将黏端修平，再用连接酶连接。B.用Klenow酶将黏端部分补平，如HindⅢ与XbaⅠ产生的黏端不能匹配，可分别用两种核苷酸填补，使之产生匹配黏端，再用连接酶连接。该法的优点在于可防止片段的自身连接。Ti质粒是什么？Ti质粒是在根瘤土壤农杆菌细胞中存在的一种染色体外自主复制的环形双链DNA分子。它控制根瘤的形成，可作为基因工程的载体。此质粒既有在细菌中表达的基因，又有在高等植物中表达的基因，这是很独特的。农杆菌转化法一般不能用于转化单子叶植物吗？•目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上，然后将该质粒转入农杆菌。双子叶植物伤口处的细胞分泌大量的酚类化合物，吸引并诱导农杆菌侵染植物细胞，导致T-DNA的加工和转移。而单子叶植物受伤后不能分泌酚类化合物，所以农杆菌不易直接侵染单子叶植物。•但是，后来经过调整和改进有关技术，如选择合适的农杆菌菌株、添加乙酰丁香酮等趋化和诱导物质，农杆菌介导的遗传转化法在水稻、小麦等单子叶植物中也获得成功，从而使其成为一种被广泛地应用于单子叶植物和双子叶植物的遗传转化的方法。这种方法的优点在于简单有效，转化的外源DNA结构完整，整合位点稳定、转化效率高、整合后外源基因结构变异小等，当然单子叶植物的转化率(20%-30%)还是比双子叶植物的转化率(80%~90%)低。与基因工程有关的蛋白质•限制性核酸内切酶（在原核生物体内提取；专一性很强，每种都有特定的识别序列和切割位点；识别的序列为反向重复序列；切断的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。）•DNA聚合酶（可在多核苷酸链的3’端添加单个的脱氧核苷酸，形成磷酸二酯键)•DNA连接酶(可连接多核苷酸链的两个断端，形成磷酸二酯键）•Bt毒蛋白(苏云金杆菌体内的一种毒蛋白，由Bt毒蛋白基因控制合成，抗虫棉就是转移了这个基因；该蛋白本身无毒，在害虫消化道内被降解为有毒的多肽，可结合在害虫的肠上皮细胞的特异性受体上，导致细胞穿孔、肿胀，造成害虫死亡。该蛋白对哺乳动物无毒害。）限制性外切酶和限制性内切酶？•限制性外切酶，一类从核苷酸链的一端开始顺序催化降解核苷酸的酶，可以分为单链核酸外切酶和双链核酸外切酶。•限制性内切酶，是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并在特定切点切割DNA双链的酶。限制性内切酶种类EcoRⅠG↓AATTCHindⅢA↓AGCTTPstⅠCTGCA↓GBamHⅠG↓GATCCBstⅠG↓GATCCSau3A↓GATCSmaⅠCCC↓GGGAluⅠAG↓CT找出规律1.目的基因的两端用不同的酶切割，质粒也用这两种不同的酶切割，可以防止目的基因或质粒的自身环化。2.两种不同的限制酶切出的平末端不同，但链接酶仍可连接，连接后原来使用的两种限制酶都不能再从连接处切开了。3.不同的限制酶切割的平末端都可以被连接酶连接。提取的目的基因一端为粘性末端，另一端为平末端，可以很好地避免自身环化。构建重组质粒时要注意：•一定要看切割的DNA有几个片段,（两端均为切点的片段）再看DNA片段的两端是否和质粒的两个切口连接.•不能破坏所有的标记基因PCR技术•PCR反应体系主要由“缓冲液、模板、dNTP、耐热DNA聚合酶、引物及其特定反应条件”组成。1.缓冲液的组成及作用•缓冲液：除了缓冲作用外还含有可以激活DNA聚合酶的Mg2+,以及有利于引物和模板退火的K+，还有DNA聚合酶的稳定剂等。2.PCR所需要的原料就是普通的四种脱氧核苷酸吗？PCR反应体系为何不加ATP？•dNTP：脱氧核苷三磷酸，包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP。（“d”代表“脱氧”；“N”代表“四种碱基”；“T”代表“三个”；“P”代表“磷酸”）•四种脱氧核苷三磷酸是消耗ATP活化的脱氧核苷酸。3.dNTP的生成需要ATP供能•dNTP由dNDP的生成过程也需要ATP供能：•dNDP+ATP→dNTP+ADP•如：GDP+ATP→GTP+ADP•CDP+ATP→CTP+ADP4.DNA的复制：3’-OH进攻5’-Pi；DNA聚合酶催化；DNA的延伸方向:5’→3’5.引物•PCR反应体系中所需引物为单链DNA片段，一般为20—30个核苷酸长度。可以与待扩增基因母链一端互补配对。所以，待扩增基因应有一段已知序列。•引物可以人工设计合成。6.引物、dNTP需要随时添加吗？•反应前需要加入足量的引物，一般达到0.25μmol/L•反应前需要加入足量的dNTP，一般达到200μmol/L•这样就足够反应进行30--40次循环。7.酶、模板需要随时添加吗？•模板102—105•----每次循环均可利用上一次合成的DNA作为模板•2.5个单位的DNA聚合酶•----酶可以重复利用•引物分子较小，运动较快，和母链碰撞的机会要多得多，所以优先与母链结合，而不是两条母链结合。8.退火时为何引物优先与母链结合？9.DNA的复制和体外的模拟模板（母链）细胞内源外源加入打开双链解链酶加热变性维持单链单链结合蛋白高温引物引物合成酶外源加入底物dNTP细胞内源外源加入聚合酶细胞内源外源加入反应环境细胞内环境缓冲液PCR循环--变性PCR循环--变性PCR循环--变性PCR循环—退火PCR循环—延伸PCR循环—延伸PCR循环—延伸PCR循环—延伸DNA测序•双脱氧链终止法双脱氧链终止法原理如果此处没有羟基，则不能继续增加脱氧核苷酸。脱氧核苷酸链不能继续延长。O碱基CPOHH12345O碱基CPOHH12345OH脱氧核苷酸的连接O碱基CPOH12345O碱基CPOHH12345H2O脱氧核苷酸的连接O碱基CPHH12345O碱基CPOHH12345OH×双脱氧核苷酸…?1--dATP,dCTP,dGTP,dTTP.+ddATP2--dATP,dCTP,dGTP,dTTP.+ddCTP3--dATP,dCTP,dGTP,dTTP.+ddGTP4--dATP,dCTP,dGTP,dTTP.+ddTTP四套反应体系:TTACGCCATTACGCCATGGT第四套反应ATGCGGTACCAT测序模板5’3’5’TA5’TACGCCA5’TACGCCATGGTAC第一套反应第二套反应TATACGCTACGCCTACGTACGCCATGTACGCCATGG第三套反应ACGTATGGTACCGCATTTATACTACGTACGCTACGCCTACGCCATACGCCATTACGCCATGTACGCCATGGTACGCCATGGTTACGCCATGGTA双脱氧链终止法荧光标记原理基因测序ddATP-绿色荧光ddTTP-红色荧光ddCTP-蓝色荧光ddGTP-橙色荧光双脱氧链终止法荧光标记原理基因测序引物都是DNA片段吗？•由于DNA聚合酶的特性，只能把单个核苷酸连接到与模板链互补的一段多核苷酸链上。所以复制时要预先在模板链的3’端结合一小段多核苷酸链。这个小片段的多核苷酸链就叫做引物。•细胞内DNA复制时，是通过引物酶合成的，是一段由10左右的核苷酸组成的RNA短链，复制完成后被修复系统移去。•PCR技术扩增DNA时，需要人工添加引物，一般为20—30核苷酸组成。为单链DNA。目的基因导入受体细胞后，是否整合到受体细胞的核DNA中？•导入植物、动物细胞的，一般采用农杆菌转化法和显微注射法，一般都整合到核基因组中。•利用线粒体或叶绿体作为新型运载体导入动植物细胞，都存在于细胞质中。•导入微生物细胞的，一般通过质粒，存在于细胞质中。•以噬菌体、动植物病毒作为载体的目的基因一般需要整合到受体细胞的染色体DNA中。原核生物中的限制性内切酶有何作用？它为什么不剪切自身DNA？•从一个角度讲，“转化”是细菌的一种适应性。提高了变异性，个体差异增大，群体适应性增强。从另一个角度讲，过多的转化会导致遗传稳定性下降。•限制性内切酶就是为了保证遗传稳定的一种防御性工具。•限制性内切酶往往与一种甲基化酶同时成对存在，它们具有识别相同碱基序列能力。甲基化酶的甲基供体为S-腺苷甲硫氨酸，甲基受体为DNA上的腺嘌呤与胞嘧啶。当限制酶作用位点上的某一些碱基被甲基化修饰后，限制酶就不能再降解这种DNA了，所以限制性内切酶只降解外源入侵的异种DNA，而不分解自身DNA，在消解外源DNA遗传干扰的同时又保护了自身遗传特性的稳定。DNA复制过程需要DNA连接酶吗？•复制方向：DNA聚合酶只能从子链的3’端添加单个的脱氧核苷酸。•冈崎片段的连接需要连接酶。Ca+处理细菌细胞可以使细胞处于感受态，易于转化。感受态什么意思？细菌可遗传变异的来源只有基因突变吗？•转化是细菌的一种基因重组的方式，可增加细菌的变异性，增强群体的适应性。•在细菌生长的某阶段，会有一个容易接受外源DNA的阶段，称为感受态。也可以通过人为处理促使其达到感受态。•认为细菌可遗传变异的来源只有基因突变是错误的。添加蛋白酶的洗衣粉不能洗涤毛丝织物，而添加纤维素酶的洗衣粉为何能洗涤棉织品？•成熟的棉纤维主要成分是纤维素。•纤维素酶包括：内切酶（是纤维素分子断裂成片段）、外切酶（从纤维素分子的糖链末端切掉两个葡萄糖分子，产生纤维二糖）、葡萄糖苷酶（使纤维二糖分解成葡萄糖）。•20世纪80年代，日本的一家公司首先推出含有纤维素酶的洗衣粉。纤维素酶本身不能去除污垢，但可以去除棉纺织品表面的浮毛以及面附着的沉积性顽顽渍，同时可以使纤维结构变得蓬松，进而使渗入到纤维深处的尘土和污垢能够与洗衣粉充分接触，进而达到更好地去污效果。•所以使用含有纤维素酶的洗衣粉可以使棉纺织品增艳出新、柔软蓬松、织纹清晰、色泽鲜艳。•但过量、超时、反复使用这种洗衣粉，