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建立分析方法色谱分离度与分离性能HPLC分离的机理分离是一个物理的过程。色谱工作者关心的基本问题-色谱峰之间的分离度totRAmAUtimetRBR=分离度tRA=组分A的保留时间tRB=组分B的保留时间w=峰的基线宽度w1/2=半峰宽)()(2BARRWWttRAB)()(176.12121BABWWttRARR分离度值等梯度洗脱的基本分离度公式N:总的理论塔板数;柱效k:容量因子(保留因子),色谱峰的保留作用α：色谱峰的相对分离程度;选择性作用影响分离度的因素容量因子对分离度的影响容量因子-----流动相组成的影响选择性影响选择性的参数降低增加较弱的溶剂较强的溶剂异丙醇/水甲醇/水乙腈/水C-2C-18容易超载不容易超载改变流动相组成改变固定相有机成分含量低的固定相有机成分含量高的固定相色谱柱温度对分离度的影响柱效计算柱效典型的流速值4.61-23.00.4-0.82.10.2-0.41.00.05-0.09柱内径mm(5um粒度)mL/minflowrate2=i.d.2i.d.12flowrate1柱外体积的影响10µL20µLTime,min.2.1x150mmF=0.2mL/min.样品体积连接管路的体积检测器体积检测器电子线路的时间常数所需分离度与柱长匹配峰对称性提高分离度增大k'增加选择性提高柱效分离度与k,n和的关系液相色谱流动相及固定相流动相与GC流动相不同，HPLC流动相为溶剂，它既有运载作用，又和固定相一起参予对组分的竞争，因此溶剂的选择对分离十分重要。1、理想的溶剂应有下列特性1）化学稳定性好，与固定相不互溶、不发生反应2）必须和检测器相适应★使用UV检测器时，溶剂截止波长要小于测量波长★使用折光率检测器，溶剂的折光率要与待测物的折光率有较大差别3）对待测物具一定极性和选择性4）高纯度。否则基线不稳或产生杂峰，同时可使截止波长增加；尽量避免使用有显著毒性的溶剂5）适宜的粘度★粘度过高，柱压增加★过低（例：戊烷、乙醚等），易产生气泡2、溶剂的极性溶剂的极性强弱用溶剂强度参数表示，强度参数值越大，表示溶剂的洗脱能力越大。序号溶剂紫外波长极限（nm）序号溶剂紫外波长极限（nm）1异辛烷1979氯仿2452正己烷19010二氧六环2153甲基叔丁基醚21011丙酮3304苯27812乙醇2105二氯甲烷23313醋酸6正丙醇24014乙腈1907四氢呋喃21215甲醇2058乙酸乙酯25616水2003、流动相的选择4、梯度洗脱特点：可以缩短总的色谱周期，提高分离效能，改善峰形，减少拖尾，可以增加灵敏度，会引起基线漂移固定相化学键合固定相方法：通过化学反应将有机分子键合在载体表面形成柱填（约有3/4以上分离问题是在化学键合固定相上进行）特点：稳定、流失小、适于梯度淋洗分离机理：兼有吸附、分配两种分离模式。化学键合的表面覆盖度决定哪种机理起主要作用。对多数键合相来说，以分配机理为主。载体主要是硅胶（表面有硅醇基）,特点为：♫可以制备成粒度分布窄的多种粒度♫机械强度好，可以填充成稳定、高效的填充床♫长期高压操作下不变形♫反压较低、柱寿命长♫较其它材料制成的柱有更高的柱效♫适用于小分子、大分子的分析和制备♫高pH值下会分解（pH＜8）键合方法：（l）硅酯化（≡Si-O-R）键合固定相（2)硅氮型（=Si-N=）共价键合固定相（3）硅烷化（≡Si-O-Si-R）键合固定相使用键合固定相应注意的问题♫硅胶键合相的稳定性♫键合相色谱分离的重现性♫键合相色谱分离的选择性♫键合相色谱柱的再生化学键合相色谱法正相色谱和反相色谱反相色谱的定义：在非极性的固定相上，用极性较大的液体作流动相进行物质分离分析的方法。即：反相色谱中键合固定相的极性要小于流动相的极性正相色谱的定义：在极性的固定相上，用极性较小的液体作流动相进行物质分离分析的方法。即：正相色谱中键合固定相的极性要大于流动相的极性正相色谱和反相色谱正相色谱和反相色谱的差别：正相色谱反相色谱固定相极性大小流动相极性小至中等中至大组分流出顺序极性小的组分先流出极性大的组分先流出流动相极性增大保留时间变小保留时间变大分离组分油溶性或水溶性的极性和强极性化合物非极性、极性或离子型化合物正相色谱低极性流动相反相色谱高极性流动相中等极性流动相中等极性流动相时间时间时间时间待测物极性：ABC正、反相色谱中极性和保留时间的关系正相键合相色谱法固定相：正相色谱中采用极性键合固定相，是把全多孔（或薄壳）微粒硅胶载体，经酸活化处理制成表面含有大量硅羟基的载体后，再和含有胺基、腈基、醚基的硅烷化试剂反应，生成表面具有胺基、腈基、醚基的极性固定相。流动相：在非极性或极性小的溶剂（如烃类）中加入适量的极性溶剂（如氯仿、醇、乙腈等），分离极性化合物。此时，组分的分配比k值随其极性的增加而增大，但随流动相极性的增加而降低。主要用于分离异构体、极性不同的化合物，特别适用于分离不同类型的化合物。反相键合相色谱法采用非极性键合固定相,是把全多孔(或薄壳)微粒硅胶载体,经酸活化处理后,和含有烷基链或苯基的硅烷化试剂反应,生成表面具有烷基(或苯基)的非极性固定相，如C18、C8流动相：流动相是采用极性较强的溶剂，如甲醇、乙腈、水和无机盐的缓冲溶液等。它多用于分离多环芳烃等低极性化合物若采用含一定比例的甲醇或乙腈的水溶液作流动相，可用于分离极性化合物若采用水和无机盐的缓冲液为流动相，则可分离一些易离解的样品，如有机酸、有机碱、酚类等具有柱效高，能获得无拖尾色谱峰的优点硅胶-烷基键合相中烷基链长对反相色谱分离的影响时间，min固定相：C1固定相：C8固定相：C181-尿嘧啶；2-苯酚；3-乙酰苯；4-硝基苯；5-苯甲酸甲酯；6-甲苯可见：反相键合色谱中，键合相碳链越长，分离效果越好。分析方法建立分析时要了解的情况想办法得到各种信息向同行了解是否做过此类样品，或有否类似样品的分析方法查文献和方法，如CA,AA,AOAC,EPA---仪器制造商的文献充分了解自己的样品对色谱柱有足够的了解掌握分离机理，自己开发方法分析时要了解的情况（续1）灵敏度的要求有多高?样品的本底是否很复杂?有多少组份要分析?对分析的精确度、准确度等有多高要求?是否因是日常检验，而要求方法容易使用?分离(制备)时要了解的情况要分离（即制备）的样品量有多大?要分离的组份在样品中的含量很高?还是微量?是否需要保持生物活性?对分离产物纯度的要求有多高?纯度或活性的鉴定如何完成?什么化合物参数能用于分离?•分子量不同/MW2000凝胶渗透/凝胶过滤离子化分子离子对/离子交换•极性不同吸附/反相色谱•同系物/苯系物反相•中性、酸和碱的混合物反相•生物分子亲和/HIC/凝胶过滤/反相•立体异构体吸附•手性化合物手性色谱结构数据数据收集固定相和流动相选择一般的具体步骤先用一根短的色谱柱用相对较高的流速使用尽可能纯度高的标准品先用高强度的洗脱液调节k值改变保留值调节α值改变选择性调节柱长度改变柱效及分离速度记住∶每次改变一个参数使用文献方法注意点色谱柱填料的种类、品牌是否相同?注意文献方法的流动相是否损害色谱柱?如色谱填料品牌不同，需要调整流动相注意色谱柱的规格：内径、柱长需要调整流速、进样量注意梯度条件了解系统的滞后体积（梯度）色谱方法转换如果没有与文献或要求相近的色谱柱转换进样量转换流速长度内径，进样量初始初始现在现在初始LDLDLDLoadLoad22)()()(内径流速初始现在初始DDDFF22)()()(常规样品分离的系统方法总的指导原则改变可以明显改善选择性的条件避免会影响方法普适性的实际问题减少必要的实验次数，尽可能地利用计算机模拟选择适用于各种常规试样的实验，以便采用同样的方法建立未知样品（离子的或中性）的HPLC分析方法先做简单易行的实验（改变色谱柱、改变pH、使用复杂的混合溶剂等属于比较难做的条件）反相HPLC分离的总体方案设计1、确定样品是属于常规的还是特殊的特殊样品包括：无机离子对映体生物分子合成的高分子碳水化合物异构体2、选择分离条件，进行第一次分离分离变量最佳的初始选择柱填料C8或C18柱结构15cm*4.6mm或25cm*4.6mm，5μm流速1.0ml/min（或2.0ml/min）流动相乙腈—水（中性样品）乙腈---缓冲液（离子型样品）（缓冲液为25--50mM磷酸缓冲液，pH2～3）对初始试验：5→100%B梯度温度常温进样量＜50μL（20μL）选择流动相•在反相色谱中常用水/乙腈•pH的选择思路选低pH可以使柱硅羟基质子化并降低其色谱活性低pH与常见酸碱官能团的pKa值相差较远，组分在此条件下的tR受pH变化影响小初期应避免使用三乙胺和离子对试剂等添加剂•准备标准样品•过滤样品•安装色谱柱•冲洗柱，平衡•平衡检测器•进样•分析结果第一次HPLC运行第一次HPLC运行选择逐步方法开发步骤•用强洗脱液开始等梯度洗脱，此后每次运行降低洗脱液强度•尝试运行梯度第一次HPLC运行无峰/响应分离度差的峰第一次运行得到的结果可能:•检测方法不正确•浓度太稀提高进样浓度，或者在无色谱柱的条件下注射少量样品改变流动相优化系统得到了色谱峰-是-否检查HPLC系统3、做初次运行并根据谱图将样品分类0.5k20等度洗脱可行，超出此范围等度洗脱可行的样品建议用梯度洗脱的样品反相保留太弱的样品改变pH、加入离子对试剂、改变柱子、改用正相色谱强保留样品用非水反相或正相条件复杂样品4、对等度方法，用初始梯度运行来估计第二次等度运行的最佳B%5、评价第二次运行中峰的质量--柱效、峰宽、峰形★峰太宽或不对称：要改变初始的分离条件（柱子、pH、添加剂等）★运行情况良好：平行实验，保证柱平衡和可重复的保留时间6、对等度方法，可以改变ACN%来改善峰间距和分离度★若有必要，ACN改为MeOH，并根据峰间距和分离度优化MeOH%★可以进一步混合ACN和MeOH成为三元溶剂系统，并优化7、若6方法中分离不充分，则可以改变分离的选择性和分离的附加条件8、对梯度方法，用改变梯度变化速度和柱温来优化峰间距和分离度★结果满意，可以按等度分离方法优化溶剂类型★分离不充分，则可以改变分离的选择性和分离的附加条件9、对梯度方法，改变初始和最后的B%、梯度变化速度、梯度形状可以改善分离度或缩短运行时间10、对等度或梯度方法，改变一个柱条件（柱长、流速、填料尺寸）可以提高分离度或降低运行时间等度分离方法反相色谱的方法开发开发过程实例色谱条件∶色谱柱：C18，4.6mm×15cm流动相：乙腈/水，不同的溶剂强度，60/40、50/50、40/60，由强渐弱（或走梯度）流速：1ml/min样品：①对羟基苯甲酸甲酯(MethylParaben)②对羟基苯甲酸丙酯(PropylParaben)③对羟基苯甲酸丁酯(ButylParaben)改变容量因子K60/4050/5040/60①②③①②②③③①(改变比例)①对羟基苯甲酸甲酯②对羟基苯甲酸丙酯③对羟基苯甲酸丁酯通过改变流动相比例改变选择性改变选择性∶α通过改变流动相组成改变选择性同样强度的不同溶剂62:38/42:58/72:28/2322，③，②，①OHCNCHOHMeOHOHTHF固定相优化：改变色谱柱0246810120246810121234567891012456789103C-18C-8Optimization10种巴比妥药物的分离（等梯度）保留时间(min)3.14相对吸光度4.555.746.447.117.7410.7611.7912.631巴比妥2阿洛巴比妥3阿普比妥4苯巴比妥5异丁比妥6环戊巴比妥7布他比妥8海索比妥9异戊巴比妥10甲苯比妥25%乙腈12456789101112313优化流动相-困难的分离01020304050607080901000204060801000201040305060708090100乙腈/水甲醇/水四氢呋喃/水甲醇146725