天然药物化学第五章 黄酮类化合物--2

第五章黄酮类化合物(flanonoids)（一）提取黄酮苷类以及极性稍大的苷元（如羟基黄酮等），一般可用丙酮、乙酸乙酯、乙醇提取。一些多糖苷类可用沸水提取。在提取花青素类化合物时，可加入少量酸（0.1%盐酸，应当慎用，避免发生水解）。大多数黄酮苷元宜用氯仿、乙醚、乙酸乙酯等中极性溶剂提取，而对多甲氧基黄酮类游离苷元，甚至可用苯等低极性溶剂进行提取。三、黄酮类化合物的提取与分离对得到的粗提物可进行下列精制处理，常用方法有：（一）溶剂萃取法利用黄酮类化合物与混入的杂质极性不同，选用不同溶剂进行地萃取可达到精制纯化目的。例如植物叶子的醇浸液，可用石油醚处理，以便除去叶绿素、胡萝卜素等脂溶性色素。而某些药料水溶液则可加入多倍量浓醇，以沉淀除去蛋白质、多糖类等水溶性杂质。三、黄酮类化合物的提取与分离有时溶剂萃取过程也可以用逆流分配法连续进行。常用的溶剂系统有：水-乙酸乙酯，正丁醇-石油醚等。溶剂萃取过程在除去杂质的同时，往往还可以收到分离苷和苷元或极性苷元与非极性苷元的效果。（二）碱提取酸沉淀法黄酮苷类虽有一定极性，可溶于水，但却难溶于酸性水，易溶于碱性水，故可用碱性水提取，再于碱水提取液中加入酸，黄酮苷类即可沉淀析出。此法简便易行，如芦丁、橙皮苷、黄芩苷的提取都应用了这个方法。三、黄酮类化合物的提取与分离兹以从槐米中提取芦丁为例说明该法的操作过程。槐米（槐树SophorajaponicaL.花蕾）加约6倍量水，煮沸，在搅拌下缓缓加入石灰乳至pH8-9，在此pH条件下微沸20-30分钟，趁热抽滤，残渣同上再加4倍水煎1次，趁热抽滤。合并滤液在60-70℃下，用浓盐酸调至pH为5，搅匀，静置24小时，抽滤。沉淀物水洗至中性，60℃干燥得芦丁粗品，于水中重结晶，70-80℃干燥得芦丁纯品。三、黄酮类化合物的提取与分离在用碱酸法进行提取纯化时，应当注意所用碱液浓度不宜过高，以免在强碱性下，尤其加热破坏黄酮母核。在加酸酸化时，酸性也不宜过强，以免生成（金羊）盐，致使析出的黄酮类化合物又重新溶解，降低产品收率。当药料中含有大量果胶、粘液等不溶性杂质时，如花、果类药材，宜用石灰乳或石灰水代替其它碱性水溶液进行提取，以使上述含羟基的杂质生成钙盐沉淀，不致溶出。这也有利于黄酮类化合物的纯化处理。三、黄酮类化合物的提取与分离（三）碳粉吸附法主要适于苷类的精制工作。通常，在植物的甲醇粗提取物中，分次加入活性炭，搅拌，静置，直至定性检查上清液无黄酮反应时为止。过滤，收集吸收炭末，依次用沸甲醇、沸水、7%酚/水、15%酚/醇溶液进行洗脱，各部分洗脱液进行定性检查（或用PPC鉴定）。三、黄酮类化合物的提取与分离二、分离现将较常用的方法介绍如下：（一）柱层析法分离黄酮类化合物常用的吸附剂或载体有硅胶、聚酰胺及纤维素粉等。此外，也有用氧化铝、氧化镁及硅藻土等。三、黄酮类化合物的提取与分离1.硅胶柱层析：此法应用范围最广，主要适于分离异黄酮、二氢黄酮、二氢黄酮醇及高度甲基化（或乙酰化）的黄酮及黄酮醇类。少数情况下，在加水去活化后也可用于分离极性较大的化合物，如多羟基黄酮醇及其苷类等。吸附规律：极性大吸附牢。如：A苷元B单糖苷C二糖苷Rf:ABC2.聚酰胺柱层析：其吸附强度主要取决于黄酮类化合物分子中羟基的数目与位置及溶剂与黄酮类化合物或与聚酰胺之间形成氢键缔合能力的大小。聚酰胺柱层析可用于分离各种类型的黄酮类化合物，包括苷及苷元、查耳酮与二氢黄酮等黄酮类化合物从聚酰胺柱上洗脱时大体有下列规律：（以下规律也适用于黄酮类化合物在聚酰胺薄层上的行为。）三、黄酮类化合物的提取与分离（1）苷元相同，洗脱先后顺序一般是：三糖苷双糖苷单糖苷苷元（2）母核上增加羟基，洗脱速度即相应减缓（3）不同类型黄酮化合物，先后流出顺序一般是：异黄酮二氢黄酮醇黄酮黄酮醇（4）分子中芳香核、共轭双键多者则吸附力强，故查耳酮往往比相应的二氢黄酮难于洗脱。OHOOOOOOOHO三、用聚酰胺柱色谱分离下述化合物,以不同浓度的甲醇进行洗脱,其出柱先后顺序为(C)→(A)→(D)→(B)OOOHOHHOOOOHOHHOOHOHOOOOOgluORhaOOOHOHOOCH3ABCD下列黄酮化合物（1）用聚酰胺柱色谱，含水甲醇梯度洗（2）用硅胶柱色谱分离，氯仿-甲醇梯度洗脱，分别写出洗脱顺序。OOHOOHOHAOOHOOHOHOHBOOGlcOOHOHOHCOORha-GlcOOHOHOHE洗脱顺序：聚酰胺：DECBA硅胶：ABCDEOORha-GlcOOHOOD影响因素：a、溶质的影响3.葡聚糖疑胶(Sephadexgel)柱层析：对于黄酮类化合物的分离，主要用两种型号的凝胶：Sephadex-G型及SephadexLH-20型。SephadexG适用于水系统SephadexLH-20适用于水及有机溶剂系统三、黄酮类化合物的提取与分离葡聚糖凝胶分离黄酮类化合物的机理是：分离游离黄酮时，主要靠吸附作用。凝胶对黄酮类化合物的吸附程度取决于游离酚羟基的数目。分离黄酮苷时，则分子筛的属性起主导作用。在洗脱时，黄酮苷类大体上是按分子量由大到小的顺序流出柱体，葡聚糖凝胶柱层析中常用的洗脱剂有：(1)碱性水溶液（如0.1mol/LNH4OH），含盐水溶液(0.5mol/LNaCl等)。(2)醇及含水醇，如甲醇，甲醇-水（不同比例）、正-丁醇-甲醇(3:1)、乙醇等。(3)其它溶剂：如含水丙酮、甲醇-氯仿等。三、黄酮类化合物的提取与分离（二）梯度pH萃取法：与酚羟基酸性有关梯度pH萃取法适合于酸性强弱不同的黄酮苷元的分离。根据黄酮类苷元酚羟基数目及位置不同其酸性强弱也不同的性质，可以将混合物溶于有机溶剂（如乙醚）后，依次用5%NaHCO3、5%Na2CO3、0.2%NaOH及4%NaOH水溶液萃取，来达到分离的目的。酸性：7，4-二OH7-或4-OH（溶于）：5%NaHCO3液5%Na2CO3液一般OH5-OH0.2%NaOH液4%NaOH液）三、黄酮类化合物的提取与分离（三）根据分子中某些特定官能团进行分离在黄酮类成分的混合物中，具有邻二酚羟基成分与无此结构的成分，可用铅盐法分离。不具有邻二酚羟基的成分可被碱式醋酸铅沉淀，达到分离的目的。与黄酮类成分混存的其它杂质，如分子中有羧基（如树胶、粘液、果胶、有机酸、蛋白质、氨基酸等）或邻二酚羟基（如鞣质等）时，也可为醋酸铅沉淀达到去杂目的。三、黄酮类化合物的提取与分离具黄酮类化合物与铅盐生成的沉淀，滤集后按常法悬浮在乙醇中，通入H2S进行复分解，滤除硫化铅沉淀，滤液中可得到黄酮类化合物。但初生态的PbS沉淀具有较高的吸附性，因此现多不主张用H2S脱铅，而用硫酸盐或磷酸盐，或用阳离子交换树脂脱铅。有邻二酚羟基的黄酮可与硼酸络合，生成物易溶于水，借此也可与不具上述结构的黄酮类化合物相互分离。在实际工作中，常将上述柱层析法与各种经典方法相互配合应用，以达到较好的分离效果。三、黄酮类化合物的提取与分离四、黄酮类化合物的波谱色谱法的应用硅胶TLC聚酰胺TLC双向纸色谱法一次二次双向纸色谱法第一向展开剂：醇性溶剂，如n-BuOH-HAc-H2O(BAW,4:1:5上层)，分配作用。Rf：苷元单糖苷双糖苷，一般苷元0.7，苷0.7。第二向展开剂：水性溶剂，如：2~6%HAc，3%NaCl等，吸附作用。Rf：(1)苷元原点附近，苷0.5,糖链越长，Rf越大；(2)苷元：黄酮(醇)，查耳酮(Rf0.02)二氢黄酮(醇)，二氢查耳酮(Rf0.1~0.3)1、黄酮类化合物在甲醇中的UV谱特征溶剂：MeOH四、黄酮类化合物的波谱OO桂皮酰系统峰带Ιλ300~400nm苯甲酰系统峰带Ⅱλ220~280nm1.黄酮、黄酮醇类峰带I和II强度相似nmIIInmIIIO2345611'2'4'6'OCHO123462.查耳酮、橙酮类带I强，带II次强峰3.异黄酮、二氢黄酮(醇)类带I弱，带II强峰IIInm1、黄酮类化合物在甲醇中的UV谱特征MeOHMeOH+NaOMeMeOH+NaOAc（熔融)MeOH+NaOAc（未熔融)MeOH+NaOAc+H3BO3MeOH+AlCl3MeOH+AlCl3+HClOOHO4'四、黄酮类化合物的波谱OOHOOHHOOHOOOOHOOAlAlOOHOOHOOHAlAlCl3HCl/H2O2+紫移30-40nmAlCl3/HCl谱图＝AlCl3：无邻二酚羟基。AlCl3/HCl谱图≠AlCl3：B环有邻二酚羟基：带I紫移30-40nm四、黄酮类化合物的波谱AlCl3/HCl谱图＝AlCl3：无邻二酚羟基。AlCl3/HCl谱图≠AlCl3：A环和B环有邻二酚羟基：带I紫移50-65nmOOOOOAlOAlAlCl3HCl/H2O+紫移50-65nm+HOOHHOOOHOHOOHHOOOHO四、黄酮类化合物的波谱AlCl3/HCl谱图＝MeOH：无3－OH或5－OHAlCl3/HCl谱图≠MeOH：可能有3－OH或5－OH1、带I红移35-55nm,可能只有5－OH2、带I红移60nm,可能只有3－OHOOHOOHHOOHOH四、黄酮类化合物的波谱黄酮类化合物的波谱2、黄酮类化合物1H-NMR谱(DMSO-d6)特征DimethylSulfoxideOOHOOHHOOHOH357δ5－OH：≈12ppmδ7－OH：≈11ppmδ3－OH：≈10ppm四、黄酮类化合物的波谱SOOOHOOHHOOHOH357黄酮类化合物的波谱2、黄酮类化合物1H-NMR谱四、黄酮类化合物的波谱A环上的芳氢：6－H：δ5.7-6.9(d,J=2.5)8－H：δ5.7-6.9(d,J=2.5)OOHOHOOHOH35682、黄酮类化合物1H-NMR谱黄酮醇四、黄酮类化合物的波谱A环上的芳氢：5-H：δ7.9－8.2（d,J=9.0）6-H：δ6.7－7.1（dd,J=9.0,2.5）8-H：δ6.7－7.0（d,J=2.5）OOHOHOOHOH35682、黄酮类化合物1H-NMR谱二氢黄酮醇四、黄酮类化合物的波谱A环上的芳氢：5-H：δ7.7－7.9（d,J=9.0）6-H：δ6.4－6.5（dd,J=9.0,2.5）8-H：δ6.3－6.4（d,J=2.5）OOROOHHOOH2'3'5'6'2、黄酮类化合物1H-NMR谱四、黄酮类化合物的波谱B环上的芳氢（H-3’,5’较为高场）：H-3’,5’：δ6.5－7.1（d,J≈8.5）H-2’,6’：δ6.5－7.9（d,J≈8.5）OOROOHHOOHOR2'5'6'2、黄酮类化合物1H-NMR谱四、黄酮类化合物的波谱B环上的芳氢：H-5’：δ6.7－7.1（d,J≈8.5）H-2’：δ7.2－7.9（d,J≈2.5）H-6’：δ7.2－7.9（dd,J≈8.5,2.5）2、黄酮类化合物1H-NMR谱C环上的氢：OOHOOHH-3（黄酮）:δ6.3(1H,s)四、黄酮类化合物的波谱H-2（异黄酮）:δ7.6－7.8(1H,s);δ8.5－8.7(1H,s,DMSO-d6)2、黄酮类化合物1H-NMR谱C环上的氢（二氢黄酮）：OOHHH23H-2:δ5.22(1H,dd,J=11.5,5.0)H-3:δ2.80(1H,dd,J=17.0,11.5)(1H,dd,J=17.0,5.0)四、黄酮类化合物的波谱化合物H-2H-3二氢黄酮醇δ4.80-5.00d(11.0)4.10-4.30d(11.0)二氢黄酮醇3-O-糖苷δ5.00-5.60d(11.0)4.30-4.60d(11.0)2、黄酮类化合物1H-NMR谱C环上的氢（二氢黄酮醇）：四、黄酮类化合物的波谱OHORHOOOHHOR2R,3R2S,3S23232、黄酮类化合物1H-NMR谱C环上的氢（查耳酮）：四、黄酮类化合物的波谱OHHαβ?H-α：δ6.50-6.70(1H,d,J=Ca.17.0)H-β：δ7.30-7.70(1H,d,J=Ca.17.0)2、黄酮类化合物1H-NMR