人感染H7N9禽流感采样以及实验室检测技术

人感染H7N9禽流感采样以及实验室检测技术湖南省疾病预防控制中心微生物检验科黄一伟2014.8.21流感病毒流行性感冒病毒（简称流感病毒）：是一种造成人类及动物患流行性感冒的RNA病毒，在分类学上，流感病毒属于正黏液病毒科理化特性：对热敏感,56℃30min可灭活；最适pH为7.0～8.0，＜3.0和＞10.0感染力很快被破坏；对紫外线敏感；对乙醚、氯仿、丙酮等有机溶剂均敏感。禽流感病毒灭活应该是65°30min，或者煮沸100°2min。GaoRB,etal,NEJM,2013MorensDMetal,NEJM,2013Dliuetal.,Lancet,2013YiGuanetal,Nature,2013采样人员•负责人感染H7N9禽流感病毒检测样本采集的操作人员必须经过生物安全培训合格，并具备相应的操作技能。•样本采集过程中操作者要加强防护，应穿戴防护服、眼罩、N95及以上水平的医用防护口罩、帽子、双层医用乳胶手套、鞋套等个体防护装备。标本采集对象•不明原因肺炎病例。同时具备以下4条的病例:1.发热(腋下体温≥38℃)；2.具有肺炎的影像学特征；3.发病早期白细胞总数降低或正常,或淋巴细胞分类计数减少；4.不能从临床或实验室角度诊断为常见病原所致的肺炎。•人感染H7N9禽流感疑似病例◆上呼吸道标本（包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、咽漱液和鼻洗液）；◆下呼吸道标本（如气管吸取物、肺洗液、肺组织标本）；◆血清标本；◆如病人死亡，应当尽可能说服家属同意尸检，及时进行尸体解剖，采集组织（如肺组织、气管、支气管组织）标本；注：应当尽量采集病例发病早期的呼吸道标本（尤其是下呼吸道标本）和发病7天内急性期血清以及间隔2-4周的恢复期血清。要求呼吸道标本：发病早期采样，每份不少于3ml血清标本每份分为2管，每管不少于0.5ml样本类型咽拭子：左手用压舌板压住患者舌头，右手用2根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子同时檫拭双侧咽扁桃体及咽后壁，应避免接触舌头，将拭子头浸入含3ml采样液的管中，弃去尾部，旋紧管盖。样本采集方法(1)样本采集方法(2)•鼻拭子：将1根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子轻轻插入鼻道内鼻腭处（通常5cm以上），停留片刻后缓慢转动退出；取另1根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子以同样的方法采集另一侧鼻孔；将上述2根拭子浸入同一含3ml采样液的管中，弃去尾部，旋紧管盖。•患儿俯卧抬头，采集者左手托住患儿的下颌部，右手持无菌拭子，将干拭子与上颚平行插入鼻孔（不要向上）直接与鼻咽后壁接触，深度与到耳导管基本一致，轻轻旋转5秒吸附分泌物，慢慢移出拭子，将拭子头浸入采样液中，弃去尾部。样本采集方法(3)拭子的要求：•标本应使用头部为合成纤维的拭子（例如，聚酯纤维）•铝或塑料做柄，不推荐棉拭子和木柄•标本采集管应包含3毫升病毒采样液（含有蛋白质稳定剂，阻止细菌和真菌生长的抗生素，缓冲液）•采样液中不能加入血清作为蛋白保护剂，可以加入BSA作为蛋白保护剂，加入BSA的采样液应-20℃保存备用。也可加入凝胶（gelatin）作为蛋白保护剂。使用商品化的无菌采样液，在分离病毒时需补加抗生素。样本采集方法(4)鼻洗液患者取坐姿，头微后仰，用移液管将5ml生理盐水注入一侧鼻孔，嘱患者同时发K音以关闭咽腔。然后让患者低头使生理盐水流出，用平皿或烧杯收集洗液。重复此过程洗两侧鼻孔漱口液用10ml生理盐水漱喉。漱时让患者头部微后仰，发“噢”声，让生理盐水在咽部转动。然后，用50ml的无菌螺口塑料管收集洗液。血清标本用真空负压采血管采集血液标本5ml，室温静置30分钟，1500～2000rpm离心10分钟，收集血清于2ml无菌螺口塑料管中。样本采集方法(5)鼻咽抽取物或呼吸道抽取物：用与负压泵相连的收集器从鼻咽部抽取粘液或从气管抽取呼吸道分泌物。先将收集器头部插入鼻腔或气管，接通负压，旋转收集器头部并缓慢退出；收集抽取的粘液，并用采样液3ml涮洗收集器1次（可用小孩导尿管接在50ml注射器上来代替收集）。呼吸道灌洗液：将收集器头部从鼻孔或气管插口处插入气管（约30cm深处），注入5ml生理盐水，接通负压，旋转收集器头部并缓慢退出；收集抽取的粘液，并用采样液涮洗收集器1次（可用小孩导尿管接在50ml注射器上来代替收集）。禽流感环境标本采集•采集粪便时一定要采集新鲜的（一般较湿润）粪便，太陈旧（干燥）的粪便对我们的检测意义不大；•在养殖户家中采集粪便标本时，由于多鸡鸭混养难以分辨鸭粪和鸡粪，最好能找到鸭子刚排泄的新鲜粪便；•采样液中最好已加入抗生素，否则回实验室要先加入抗生素处理；样本的运输1、病毒培养物按照A类感染性物质进行包装运输，其他感染性物质按照B类感染性物质进行包装运输。2、病例的临床标本采集后，县级疾病预防控制机构和病例收治的医疗机构要密切配合，按照生物安全的相关规定进行包装，在24小时内送到当地流感监测网络实验室进行检测。样本的分装与保存•样本的分装：采集的呼吸道标本每份分为3管，每管不少于1ml。血清标本每份分为2管，每管不少于0.5ml。并填写湖南省不明原因肺炎病例疑似人禽流感病例标本送检单。•样本的保存：所有呼吸道标本应保存在4℃，并尽快放置在‐70℃。如果没有‐70℃度冰箱，标本应保存在4℃，但不超过24小时。切勿置于-20℃长期保存。血清样本应置-20℃长期保存。注：标本运送期间应避免反复冻融。病原学检测•（1）甲型流感病毒抗原筛查。呼吸道标本甲型流感病毒抗原快速检测阳性。但仅可作为初筛实验。•（2）核酸检测。对患者呼吸道标本采用realtimePCR（或RT-PCR）检测H7N9禽流感病毒核酸。•（3）病毒分离。从患者呼吸道标本中分离H7N9禽流感病毒。•（4）动态检测双份血清H7N9禽流感病毒特异性抗体水平呈4倍或以上升高。检测策略•不明原因肺炎病例标本检测：建议各流感监测网络实验室收到不明原因肺炎标本后，要在12小时内进行标本处理和核酸检测，同时进行甲型/乙型通用引物，甲型H1N1流感，季节性H3N2流感，A（H5）、A(H7和N9)亚型流感病毒的检测。如果H5或H7/N9亚型检测阳性，在生物安全三级实验室进行流感病毒的分离鉴定，无病毒分离条件的实验室，将标本在24小时内送国家流感中心进行复核鉴定和病毒分离。样品采集/接收•对于人禽流感，咽拭子比鼻拭子检出率高。病毒滴度：气管吸取物咽拭子鼻拭子，粪便中可能可检出。•标本送至实验室后，立即进行处理，避免反复冻融。将原始标本分为三份，取一份进行检测，其余保存在－70℃或－70℃以下，短时间保存在4℃，不要保存在－20℃。•在生物安全二级实验室从事相关实验室活动时，操作者应穿戴眼罩、N95及以上水平的医学防护口罩、防护服、帽子、双层乳胶手套、鞋套等个体防护装备；实验活动应当有２名以上的工作人员共同进行。核酸检测流程•1、样品采集/接收•2、核酸提取•3、反应体系配制•4、荧光PCR扩增•5、结果判断结果判断•1.探针/引物的阴性对照反应中得到的荧光增长曲线不应该超过阈值线，应无CT值或为CT值为零。如果一个或者多个引物和探针的阴性反应出现了假阳性，则样品可能已经被污染。那么整个实验过程是无效的，严格的按照步骤规则重新实验。•2.在40个循环之前，阳性对照反应应出现阳性结果，且CT值在20–30之间。如果没产生预期的阳性结果则视为无效，应严格遵照操作程序进行重复实验。确定PTC反应失败原因，订正并记录错误原因及更改方案。不再使用没产生预期结果的PTC试剂。•3.当所有对照成立，检测标本在35个循环内出现荧光信号，则相应引物和探针阳性；若CT值在35–40间，应重复确认，如CT值还在40内可判断为阳性；CT值超过40，视该样本为阴性(A型引物探针以35为阈值，其他分亚型引物探针以38为阈值)。结果判断•4.所有的临床标本RNA检测都必须为阳性，且CT值在35.0以内才足可以证明样品的质量是可接受的。如果临床标本RNA检测为阴性，则可能是以下原因：•4.1临床样本核酸提取不正确导致RNA的丢失或临床标本里存在大量的RT-PCR反应抑制剂。•4.2样品中人细胞成分太少，以至于不能检测到。•4.3反应液配制错误或程序设置错误。实验操作注意事项－避免污染•应特别注意假阳性产生。推荐以下预防污染的方法：–(a)实验准备与核酸提取使用独立区域；–(b)实验准备与核酸提取使用专用设备（如移液器，微量离心机）和耗材（如微量离心管，吸头）；–(c)实验开始后穿清洁工作服，并使用新的一次性无粉手套；–(d)不同样本操作之间，以及怀疑可能污染的情况下均更换手套；–(e)试剂和反应管的盖子应尽量关闭。阳性标本送检要求若当地流感监测网络实验室检测结果为H7亚型禽流感病毒核酸阳性时，应当于48小时内将其中2管呼吸道相关原始标本送省级疾控中心网络实验室。省级疾控中心网络实验室在接到医疗机构和本省网络实验室送检的H7和H5亚型阳性的呼吸道标本时，未能开展病毒分离的省级疾控中心网络实验室将阳性病例的原始标本48小时内送国家流感中心开展病毒分离。各医疗机构采集的双份血清标本48小时内送当地流感监测网络实验室，由当地网络实验室48小时内将血清标本分别送省级疾控中心和国家流感中心开展相关抗体检测，进行病例诊断。对于甲型通用引物阳性而不能区分型别或亚型的毒株和阳性标本要求在48小时内送至国家流感中心。环境标本检测送检要求对人感染H7N9禽流感确诊病例可能暴露的禽类饲养或交易等场所，采集禽类粪便、笼具涂拭标本和环境污水等标本2周内开展甲型流感通用引物、H5、H7和H9亚型检测。没有条件开展病毒分离的实验室在2周内将阳性标本送国家流感中心。具体技术要求可参考《职业暴露人群血清学和环境高致病性禽流感监测方案（2011年版）》。H7N9禽流感病毒实验室检测策略流程图甲通阳性H7/H5阴性2周内完成血清标本及医疗机构检测H7阳性标本血清标本省级CDC实验室国家流感中心2周内完成检测48h内具备条件开展病毒分离毒株阳性未能开展病毒分离48h内毒株和标本医疗机构疑似病例双份血清样本呼吸道标本无条件开展检测或甲型抗原检测阳性24h内核酸检测H7阳性，48h内送当地CDC网络实验室，进一步送省CDC甲型快速抗原检测阳性的标本医疗机构未进行过检测的疑似病例标本强化监测采集的ILI和SARI病例标本H5，H7H5/H7阳性阴性检测结束停止甲、乙型通用及H5，H7季节性流感检测阴性当地CDC流感网络实验室季节性流感检测病毒分离24h内24h内48h内具体方案人感染H7N9禽流感疫情防控方案（第3版）人感染H7N9禽流感诊疗方案（2014年版）人感染H7N9禽流感病毒标本采集及实验室检测策略职业暴露人群血清学和环境高致病性禽流感监测方案（2011年版）全国流感监测方案（2010年版）