2010-第14章基因重组和基因工程

目录基因重组和基因工程GeneticRecombinationandGeneticEngineering第14章目录二、重组DNA技术三、重组DNA技术与医学一、自然界DNA重组和基因转移内容目录DNA重组接合作用(conjugation)转化作用(transformation)转导作用(transduction)转座(transposition)同源重组(homologousrecombination)目录发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologousrecombination)，又称基本重组（generalrecombination）。一、同源重组内切酶(recBCD)DNA侵扰(recA)分支迁移(recA)内切酶(recBCD)DNA连接酶5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´3´3´5´3´5´3´3´5´5´3´5´3´5´3´Holiday中间体5´3´5´3´5´3´5´3´Holiday中间体5´3´5´3´5´3´5´3´5´5´3´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´内切酶(ruvC)内切酶(ruvC)DNA连接酶DNA连接酶片段重组体拼接重组体目录二、细菌的基因转移与重组（一）接合（conjugation）质粒目录（二）转化（transformation)目录（三）转导(transduction)目录插入序列（IS因子）特征：很小的DNA片段末端具有倒置重复序列10三、DNA的转座目录转座作用的机制限制性内切酶切开靶序列转座子插入，形成具有单链粘性末端的转座子修补缺刻，形成直接重复序列。目录分为复制型和非复制型两大类复制型非复制型目录遗传效应引起插入突变，可导致基因表达失活。产生新的基因。产生的染色体畸变，引起DNA缺失或倒位。引起的生物进化，可产生新的生物学功能的基因。目录二、重组DNA技术三、重组DNA技术与医学一、自然界DNA重组和基因转移内容目录限制性核酸内切酶逆转录酶T4DNA连接酶常用的工具酶目录限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease,RE)是识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+目录目录POO-O-OHO5’POO-O-O3’3’5’DNA连接酶ATPADP5’3’5’3’目录DNA连接酶(DNAligase)目录二、重组DNA技术基本原理目录基因克隆过程示意图以质粒为载体的DNA克隆过程目录（一）目的基因的获取1.化学合成法2.基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)3.cDNA文库(cDNAlibrary)4.聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)限制酶切位点限制酶消化除去中间片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色体DNA限制酶部分消化外源DNA与载体DNA混合连接反应体外包装用重组噬菌体感染大肠杆菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段基因文库基因组文库目录cDNA文库构建:用噬菌体载体目录目录克隆载体(cloningvector)扩增DNA表达载体(expressionvector)让DNA表达成蛋白质（二）载体的选择和构建目录载体的要求能自主复制；具标记，便于筛选；有多个单一酶切位点有一定的容量目录质粒(plasmid)目录PolylinkerMCS:multiplecloningsitePromega目录Invitrogen真核表达载体示例目录噬菌体载体目录粘性质粒(cosmid)酵母人工染色体(yeastartificialchromosome,YAC)细菌人工染色体(bacterialartificialchromosome,BAC)动物病毒DNA改造的载体（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）BamHⅠ切割反应GGATCCCCTAGGT4DNA连接酶15ºCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG载体DNA用BamHⅠ切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG重组体GCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCG载体自连目的基因自连（三）基因与载体连接单酶切克隆目录双酶切克隆目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶连接重组体载体自连目的基因自连平端连接目录质粒DNA：制备感受态细菌，转入（四）重组DNA转入宿主细胞噬菌体DNA：包装后吸附感染细菌病毒载体：包装后感染受体细胞目录抗药性标志补救(markerrescue)原位杂交免疫方法（五）重组体的筛选α互补利用α互补原理筛选重组体pUC18原位杂交鸡的β肌球蛋白的克隆和检出免疫学方法目录（六）克隆基因的表达原核表达体系（细菌）：优点：培养方法简单，迅速、经济又适合大规模生产工艺，经验丰富不足：只用于表达cDNA不能进行翻译后修饰易形成不溶性包涵体目录真核表达体系（酵母，昆虫细胞，哺乳细胞等）：优点：可进行适当的修饰，蛋白可分布于胞内一定区域并积累不足：操作麻烦，费时，不经济目录基因重组总结目录二、重组DNA技术三、重组DNA技术与医学一、自然界DNA重组和基因转移内容目录一、疾病基因的发现与克隆家族性耳聋鼻咽癌目录生物制药目录生物药物现状与展望截止到2004年2月,美国FDA批准的生物技术药物共79种。2005年底，美国共有1415家生物技术公司，其中329家是上市公司。全部上市公司2005年底的总市值超过4100亿美元。2000年，在全球十大畅销药物中，生物技术药物只有安进的Epogen和强生的Procrit（epoetinalfa）。2008年的十大畅销药物中，有5只生物技术产品（Avastin，Enbrel，Epogen/Procrit，Remicade和Rituxan）名列其中。2014年，在前100只畅销药物中，生物技术药物所占比例将超过50%，而在2000年和2008年时分别仅为11%和28%。目录发展生物制药的领域：1激素类：胰岛素，生长激素2细胞因子：干扰素、集落刺激因子、白细胞介素、肿瘤坏死因子、趋化因子、转化生长因子、生长因子、促红细胞生成素（EPO)等。3溶血栓药物：纤溶酶原、链激酶、尿激酶、葡激酶、水蛭素等目录4血液代用品：定型红细胞、万能型红细胞、重组血红蛋白5基因工程抗体：治疗肿瘤、抗移植反应、抗病毒、抗过敏6重组可溶性受体：纤溶酶原、链激酶、尿激酶、葡激酶、水蛭素等目录7病毒疫苗（亚单位疫苗和DNA疫苗）：HIV、乙肝、丙肝、戊肝、EBV，单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、轮状病毒、登革热病毒、埃博拉病毒、SARS8细菌疫苗：9寄生虫疫苗：目录基因诊断(geneticdiagnosis)：在DNA水平分析、鉴定遗传疾病所涉及基因的置换、缺失或插入等突变。三、基因诊断与治疗目录基本过程：区分或鉴定DNA的异常分离、扩增待测的DNA片断目录（二）基因治疗的概念定义基因治疗(genetherapy)是向有功能缺陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。目录1.产前诊断2.携带者测试3.症候前诊断4.遗传病易感性四、遗传疾病的预防目录要求【掌握】1．基因重组和重组DNA技术相关概念；2．重组DNA技术基本原理及操作步骤【熟悉】。1．接合、转化、转导、转座作用；2．重组体的筛选；3．克隆基因的表达；4．基因载体的筛选；5．DNA诊断与基因治疗。【了解】1．重组DNA技术重要的工具酶；2．重组DNA技术与医学的关系。