第六章-色谱分析法导论

第九章色谱分析法导论仪器分析ChapterNineGuideofChromatography§8.1概述色谱法也叫层析法，它是一种高效能的物理分离技术，将它用于分析化学并配合适当的检测手段，就成为色谱分析法。1、色谱法的产生色谱法是一种分离技术，它是俄国植物学家茨维特1906年创立的。分离植物叶子中的色素时，将叶片的石油醚（饱和烃混合物）提取液倒入玻璃管中，柱中填充CaCO3粉末（CaCO3有吸附能力)，用纯石油醚洗脱（淋洗）。一、色谱分析法简介(1）粗叶绿素+石油醚（2）石油醚流动相相对运动固定相（吸附剂）CaCO3胡萝卜素利用不同物质叶黄素在流动相与固定相叶绿素作用时的行为差异得到分离(吸附)色素受两种作用力影响（1）一种是CaCO3吸附，使色素在柱中停滞下来（2）一种是被石油醚溶解，使色素向下移动各种色素结构不同，受两种作用力大小不同，经过一段时间洗脱后，色素在柱子上分开，形成了各种颜色的谱带，这种分离方法称为色谱法。色谱法基本条件（1）一定具有两相；固定相和流动相（2）分离：利用组分在两相中分配系数或吸附能力的差异进行分离Martin,A.J.P.Synge,R.L.M.1952年Nobel化学奖2、色谱法的发展1931年库恩奥地利化学家胡萝卜素植物色素分离20世纪30年代离子交换色谱建立1940年吸附色谱与电泳相结合1941年分配色谱创立1952年气相色谱法建立1968年高效液相色谱法建立1975年之后离子色谱、超临界流体色谱、高效毛细管电泳、场流动分级分离二、色谱分离基本原理：由以上方法可知，在色谱法中存在两相，一相是固定不动的，我们把它叫做固定相；另一相则不断流过固定相，我们把它叫做流动相。色谱法的分离原理就是利用待分离的各种物质在两相中的分配系数、吸附能力和亲和能力等的不同来进行分离的。三、色谱分类方法：色谱分析法有很多种类，从不同的角度出发可以有不同的分类方法。色谱法液相色谱法气相色谱法气-液色谱法气-固色谱法液-固色谱法液-液色谱法（一）从两相的状态分类：（二）按固定相的形式分类：按固定相的状态可分为：柱色谱（Columnchromatography）：固定相装在色谱柱中；试样沿一个方向移动而进行分离的色谱法。薄层色谱法(thinlayerchromatography)：将适当粒度的吸附剂（通常为硅胶）作为固定相涂布在玻璃板上成薄层，把试样点在吸附剂上，然后用流动相展开，各组分在吸附剂上的不同位置以斑点形式显现，从而达到分离目的。纸色谱法(paperchromatography)：利用滤纸中含有的水分作固定相，试验操作类似薄层色谱法，达到分离目的。（三）按分离原理分类：吸附色谱法：利用吸附剂（固定相一般是固体）表面对不同组分吸附能力的差别进行分离的方法；最常用的吸附剂是硅胶：SiOOOOHSiSiSiOOOOOOHOOSiSiOOOOOH分配色谱法：利用不同组分在两相间的分配系数的差别进行分离的方法。包括：气液分配色谱法（固定相为液体的GC）液液分配色谱法（纸色谱）离子交换色谱法:利用离子交换树脂作为固定相，树脂上可交换的平衡离子与流动相中具有相同电荷的试样离子进行可逆性交换，根据各种离子对于树脂上离子交换基团的交换能力的差别而使之分离的方法。+-++-+固定相流动相固定相流动相凝胶色谱法：利用凝胶作为固定相，液体作流动相。由于凝胶颗粒表面和内部具有一定大小的孔穴，当大小不同的试样分子随流动相经过凝胶颗粒时，它们渗入微孔的程度也有所不同，因而在色谱柱中滞留的时间也存在差异而使之分离。这种分离方法称为分子筛色谱法或排阻色谱法。P.151图9-2大分子渗入微孔的程度低，滞留时间短；小分子渗入微孔的程度高，滞留时间长；葡聚糖凝胶(sephadexLH型)(sephadexG型)OOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOHOHOHOHOHOHOHOHOOHOHOHOHHO凝胶柱色谱P38一种新分离技术，利用不同组分与固定相（固定化分子）的高专属性亲和力进行分离的技术称为亲和色谱法，常用于蛋白质的分离。3.5四、色谱法的特点优点：“三高”、“一快”、“一广”缺点：高选择性——可将性质相似的组分分开高效能——反复多次利用组分性质的差异产生很好分离效果高灵敏度——10-11~10-13g，适于痕量分析分析速度快——几~几十分钟完成分离一次可以测多种样品应用范围广——气体，液体、固体物质化学衍生化再色谱分离、分析对未知物分析的定性专属性差需要与其他分析方法联用(GC-MS,LC-MS)随着被分离样品种类的增多，该方法广泛地用于无色物质的分离，“色谱”名称中的“色”失去了原有的意义，但“色谱”这一名称沿用至今。4.1每种色谱系统都包含两个相：相对不动的固定相；相对固定相运动的流动相。4.各种色谱方法的共同特点4.2每种色谱系统都是相同的基本分离过程：色谱柱固定相检测器浓度时间迁移速度：两色谱带（峰）间的距离（色谱分离的必要条件）宏观运动形式扩散程度：各色谱带（峰）的宽度（影响色谱分离效果的因素）§8.2色谱图及色谱常用术语一、色谱图混合物样品（A+B）→色谱柱中分离→检测器→记录下来。组分从色谱柱流出时，各个组分在检测器上所产生的信号随时间变化，所形成的曲线叫色谱图。记录了各个组分流出色谱柱的情况，又叫色谱流出曲线二、色谱图中的基本术语1、基线—在实验操作条件下，色谱柱后没有组分流出的曲线叫基线。稳定情况下，一条直线。基线上下波动称为噪音。二、色谱图中的基本术语2、色谱峰的高度h（1）峰高h—色谱峰最高点与基线之间的距离。峰高低与组分浓度有关，峰越高越窄越好。二、色谱图中的基本术语h3.色谱峰的宽度标准偏差—σ峰高0.607倍处的色谱峰宽的一半。二、色谱图中的基本术语σ峰底宽Wb—色谱峰两侧拐点所作切线在基线上的距离半峰宽W1/2—峰高一半处色谱峰的宽度Wb峰形－－色谱系统是否适合组分的分离以不对称因子Sa表示Sa=CD/(2CB’)前伸峰Sa1脱尾峰Sa14.色谱峰面积A——色谱峰与峰底所围的面积。对于对称的色谱峰A=1.065hW1/2对于非对称的色谱峰A=1.065h(W0.15+W0.85)/2二、色谱图中的基本术语5.色谱保留值——定性的依据组分在色谱柱中停留的数值，可用时间t和所消耗流动相的体积来表示。组分在固定相中溶解性能越好，或固定相的吸附性越强，在柱中滞留的时间越长，消耗的流动相体积越大，固定相、流动相固定，条件一定时，组分的保留值是个定值。二、色谱图中的基本术语（1）死时间tm/t0——不被固定相吸附或溶解的组分流经色谱柱所需的时间。从进样开始到柱后出现峰最大值所需的时间。气相色谱—惰性气体（空气、甲烷等）流出色谱柱所需的时间。5.色谱保留值——定性的依据t0(2)保留时间tR———组分流经色谱柱时所需时间。进样开始到柱后出现最大值时所需的时间。操作条件不变时，一种组分有一个tR定值，定性参数。（3）调整保留时间t’R—扣除了死时间的保留时间。t’R=tR-t0又称校正保留时间，实际保留时间。t’R体现的是组分在柱中被吸附或溶解的时间。二、色谱图中的基本术语t’R保留值用体积表示：（4）死体积V0—不被固定相滞留的组分流经色谱柱所消耗的流动相体积称死体积，色谱柱中载气所占的体积。V0=t0F0柱后出口处流动相的体积流速mL/min（5）保留体积VR—组分从进样开始到色谱柱后出现最大值时所需流动相体积，组分通过色谱柱时所需流动相体积VR=tRF0（6）调整保留体积V’R—扣除了死体积的保留体积，真实的将待测组分从固定相中携带出柱子所需的流动相体积。V’R=t’RF0二、色谱图中的基本术语V0、t0与被测组分无关，因而V’R.t’R更合理地反映了物质在柱中的保留情况。分离度分离度(R):某两个相邻组分通过色谱系统后被分离的程度----------组分的迁移、自身的扩散有关。2112)(2WWttRRRR值越大，表示两个峰分开的程度越大，R＝1时，两个组分间只有2％交盖重叠，R＝1.25时，两组分就基本上分离开了。三、分配平衡在一定温度下，组分在流动相和固定相之间所达到的平衡叫分配平衡，组分在两相中的分配行为常采用分配系数K和分配比k’来表示。试样中各组分具有不同的k值是分离的基础！=cs/cm组分在固定相中的浓度组分在流动相中的浓度K=1、分配系数K(浓度分配系数)讨论：1)每个组分在各种固定相上的分配系数k不同，试样一定时，k主要取决于固定相性质，选择适宜的固定相可改善效果2)一定温度下，组分的分配系数k越大，出峰越慢，某组分的k＝0时，即不被固定相保留，最先流出K只与固定相和温度有关。与两相体积、柱管特性和所用仪器无关。smmmssmmcVkcV组分在固定相中的质量组分在流动相中的质量2.分配比：在一定温度和压力下，组份在两相间的分配达平衡时，分配在固定相和流动相中的质量比，称为分配比。它反映了组分在柱中的迁移速率。又称保留因子。也叫容量因子或容量比。’分配比k’的求算：k’也等于组分的校正保留时间与死时间的比值'0Rtkt因此，k’可通过实验测得。由此也可知道，k可表示出组分在柱中停留时间的长短。k’越大，停留时间也就越长。’称为相比率，它也是反映色谱柱柱型特点的参数。对填充柱，=6~35；对毛细管柱，=60~600。//sssmmmmscmVVKkkcmVV3.K与k’的关系：’（7）相对保留值2，1—在相同操作条件下，组分2与相邻组分1的校正保留值的比值。二、色谱图中的基本术语12121.2RRRRVVtt注意：K或k’反映的是某一组分在两相间的分配；而是反映两组分间的分离情况！当两组分K或k’相同时，=1时，两组分不能分开；当两组分K或k’相差越大时，越大，分离得越好。也就是说，两组分在两相间的分配系数不同，是色谱分离的先决条件。和k是计算色谱柱分离效能的重要参数！总结：（1）色谱峰的位置即保留值—进行定性分析。（2）色谱峰的h.A—进行定量分析。（3）色谱峰的位置及峰的宽度—可评价色谱柱效的高度。2.01.000123456(columnvolumes)A280nm时间(min)信号强度51515.518aGCspectrumWritedownthefollowing:有几个峰？哪些（个）是空气峰？哪个（些）是样品峰？每个样品峰的保留时间？死时间？校正保留时间？相邻两个样品峰的分离度？并由此值判断分离效果。（设W均为1min）classwork201714§6-3色谱法的基本理论一、塔板理论最早由Martin和Synge提出塔板理论，把色谱柱比作一个精馏塔，沿用精馏塔中塔板的概念来描述组分在两相间的分配行为，同时引入理论塔板数作为衡量柱效率的指标。马丁辛格塔板理论是描述色谱柱中组分在两相间的分配状况及评价色谱柱的分离效能的一种半经验式的理论。塔板理论将一根色谱柱当作一个由许多塔板组成的精馏塔，用塔板概念来描述组分在柱中的分配行为。塔板是从精馏中借用的，是一种半经验理论，但它成功地解释了色谱流出曲线呈正态分布。一、塔板理论塔板理论假定：1）组分在各塔板内两相间的分配瞬间达至平衡，达一次平衡所需柱长为理论塔板高度H；塔板之间不连续；2）流动相以不连续方式加入，即以一个一个的塔板体积加入;3）所有组分开始时都存在于第0号塔板上，塔板之间无分子扩散4）某组分在所有塔板上的分配系数相同；分离过程如下图所示一、塔板理论对一个色谱柱来说，若色谱柱长度固定L，每一个塔板高度H越小，塔板数目越多，分离的效果越好，柱效越高。塔板数用N表示。N=L/H或H=L/NH越小，N越多，分离效果越好，用H,N评价柱效。反映的是色谱柱的塔板数N和组分色谱峰峰宽及保留时间的关系。由塔板理论导出N与Wb，W1/2的关系（推导步骤省略）。**N=5.54(tR/W1/2)2=16(tR/Wb)2有时N大，分离效果也不好，因用tR内含tm，后来改用有效塔板数。一、塔板理论N有效=5.54(t’R/W1/2)2=16(t’R/Wb)2