酶的作用机制和酶的调节101214

第三部分酶的作用机制和酶的调节一、酶的活性部位二、酶催化反应的独特性质三、影响酶催化效率的有关因素四、酶催化反应机制的实例五、酶活性的调节控制六、同工酶一、酶的活性部位在酶蛋白分子上，酶的特殊催化能力只局限在酶分子的一定区域，也就是说，只有少数一些特异的氨基酸残基与酶的催化能力直接相关。这些氨基酸残基比较集中的区域，也就是酶分子中与酶活力直接相关的区域称为酶的活性中心（活性部位）。（一）酶活性部位的特点(P384)底物结合部位（决定酶的专一性）活性部位催化部位（决定酶所催化反应的性质）酶活性部位的特点（1）活性部位在酶分子的总体中只占相当小的部分，往往只占整个酶分子体积的1%-2%；（6）活性中心的空间构象不是刚性的，在与底物接触时表现出一定的柔性和运动性。（2）酶的活性部位是一个三维实体，具有三维空间结构。活性部位在一级结构上可能相距甚远，但在空间结构上相互靠近;（3）酶的活性部位并非与底物恰好互补，而是需要通过诱导契合酶和底物结合；（4）酶的活性部位是位于酶表面的一个裂隙内，裂隙内是一个相对疏水的环境，从而有利于同底物的结合；（5）底物通过次级键较弱的力结合到酶上;（二）研究酶活性部位的方法(P385)1.酶分子侧链基团的化学修饰法：①非特异性共价修饰：某些化学试剂能和酶蛋白中AA残基的侧链基团反应而引起共价结合、氧化还原等修饰反应，使基团结构任意改变。如引起酶活力变化-－此基团为必需(基团)；不引起酶活力变化--此基团为非必需。③亲和标记法：合成与底物结构相似的共价修饰剂（活性部位指示试剂）。②特异性共价修饰：某化学试剂专一性地修饰酶活性部位的某一AA残基，使酶失活。2.动力学参数测定法：酶活性部位氨基酸残基的解离状态与酶的活性直接相关。3.X射线晶体结构分析法：通过解析酶分子三维结构，了解酶活性部位AA残基所处相对位置与实际状态，以及与活性部位有关的其它基团。4.定点诱变法（分子生物学方法）：现已有几百个酶的基因被克隆。根据蛋白质结构研究的结果，利用定点诱变技术，改变编码蛋白质基因中的DNA顺序，研究酶活性部位氨基酸。（二）研究酶活性部位的方法1.酶分子侧链基团的化学修饰法：二、酶催化反应的独特性质（1）酶反应分为两类：仅涉及电子转移和涉及电子和质子两者或者其他基团的转移。①活性部位存在1个以上催化基团---协同催化。②存在结合部位。③多底物反应存在多个结合部位。④底物由于与酶的结合，分子中间产生张力，易形成过渡态复合物。（5）除具有进行催化反应所必需的活性基团外，还有别的特性，使更复杂的多底物反应顺利进行。（2）催化作用是以氨基酸侧链上的功能基团和辅酶为媒介。（3）酶催化反应的最适pH范围通常狭小。（4）酶分子很大，而活性部位通常只比底物稍大一些，一个巨大的酶结构对稳定活性部位的构象是必要的。酶催化反应的独特性质(P388)三、影响酶催化效率的有关因素（一）底物和酶的邻近效应与定向效应(P388)1.邻近效应(approximation)：指酶与底物结合成ES后，使底物和底物之间(如双分子反应)、酶催化基团与底物之间结合于同一分子而使有效浓度得以极大升高，从而使反应速率大大增加的一种效应。2.定向效应(orientation)：指反应物的反应基团之间、酶的催化基团与底物的反应基团之间的正确取位产生的效应。（一）底物和酶的邻近效应与定向效应邻近效应和定向效应的共同作用可使酶促反应速度升高108倍。邻近和定向效应共同提高酶促反应速率的机制：酶把底物分子从溶液中富集出来，使它们固定在活性中心附近，反应基团相互邻近，同时使反应基团的分子轨道以正确方位相互交叠，反应易于发生。3.邻近效应与定向效应对反应速度的影响：①使底物浓度在活性中心附近很高。②酶对底物分子的电子轨道具有导向作用。③酶使分子间反应转变成分子内反应。④邻近效应和定向效应对底物起固定作用。（二）底物的形变(distortion)和诱导契合(inducedfit)当酶遇到专一性底物时，酶中某些基团或离子可使底物分子内敏感键中的某些基团的电子云密度增加或降低，产生“电子张力”，使敏感键的一端更加敏感，降低了底物的活化能，使底物接近过渡态，更易发生改变。（二）底物的形变和诱导契合①酶从低活性形式转变为高活性形式，利于催化。②底物形变，利于形成ES复合物。③底物构象变化为过渡态结构，大大降低活化能。图１０－３ZnZnGlu270Tyr248Arg145底物羧肽酶结合底物前后构象变化结合底物之后的羧肽酶未结合底物的羧肽酶酸碱催化：是通过瞬间的向反应物提供质子或从反应物接受质子以稳定过渡态加速反应的一类催化机制。（三）酸碱催化（acid-basecatalysis）分两类狭义的（专一的）酸碱催化：在水溶液中通过高反应性的H+、OH-进行催化。广义（总）酸碱催化：通过H+、OH-以及能提供H+及OH-的供体进行的催化。（三）酸碱催化（acid-basecatalysis）组氨酸咪唑基解离常数6.0，接近生物体液pH，即在中性条件下，有一半以酸形式存在，另一半以碱形式存在(既可作为质子供体，又可作为质子受体)，且供出、接受质子十分迅速。因此，尽管蛋白质中His含量少，却十分重要。推测His很可能在进化过程中，不是作为一般的结构蛋白成分，而是被选择作为酶分子中的催化结构而保留下来的。影响酸碱催化反应速率的因素：酸或碱的强度（pk值）（P391）质子传递的速率。（四）共价催化(covalentcatalysis)酶作为亲核基团或亲电基团，与底物形成一个反应活性很高的共价中间物。共价催化：催化剂通过与底物形成反应活性很高的共价过渡产物，使反应活化能降低，从而提高反应速度的过程。酶亲核基团：Ser-OH，Cys-SH，His-N、Asp-COOH；底物亲电中心：磷酰基（-P=O），酰基（-C=O），糖基（Glu-C-OH）某些辅酶，如焦磷酸硫胺素和磷酸吡哆醛等也可以参与共价催化作用。（五）金属离子催化（P393）金属酶:含紧密结合的金属离子，Fe2+、Cu2+、Zn2+、Mn2+、Co3+金属-激活酶：含松散结合的金属离子，Na+、K+、Mg2+、Ca2+金属离子参加的四种主要催化途径：（1）通过结合底物为反应定向（2）通过自身价数的改变参加氧化还原反应（3）屏蔽底物或酶活性中心的负电荷（4）金属离子通过水的离子化促进亲核催化。（六）多元催化和协同效应（P394）在酶催化反应中，常常是几个基元催化反应（如酸碱催化和共价催化）配合在一起共同起作用。（七）活性部位微环境的影响⑴疏水环境（酶分析表面的裂缝）介电常数低，加强极性基团间的作用。⑵电荷环境在酶活性中心附近，往往有一电荷离子，可稳定过渡态的离子。四、酶催化反应机制的实例(自学)（一）溶菌酶（lysozyme）（P394）是NAG（N-乙酰氨基葡萄糖）和NAM（N-乙酰氨基葡萄糖乳酸）的聚合物。之间通过β（1-4）糖苷键相连。溶菌酶存在于蛋清和动物的眼泪中，其生物学功能是催化某些细菌细胞壁多糖的水解，从而溶解这些细菌的细胞壁。（一）溶菌酶溶解细胞壁多糖（P396,图10-10）NAG:N-乙酰氨基葡萄糖；NAM:N-乙酰氨基葡萄糖乳酸β（1-4）糖苷键溶菌酶-底物复合物酶切位点底物分子酶分子（P397,图10-13）Asp52Glu35（极性区）（非极性区）溶菌酶活性中心与底物结合示意图（P398,图10-15）（广义酸碱催化）极性区底物H2O产物键的断裂酶的活性中心(非极性)HO-E环C1+活性中心（极性区）溶菌酶催化反应机理（P398-399）RNase-底物复合物底物RNase活性中心氨基酸残基（二）胰核糖核酸酶RNaseA（P399-402）（三）羧肽酶A（P402-405）羧肽酶活性中心Zn2+的中心作用（P403图10-27）羧肽酶活性中心必需基团与底物间的结合（P403图10-28）ZnZn羧肽酶结合底物前后构象变化（P404图10-29）羧肽酶活性中心的共价催化机理145（四）丝氨酸蛋白酶（胰凝乳蛋白酶）P405-410胰凝乳蛋白酶分子中催化三联体构象His57Asp102Ser195Asp102His57Ser195His57102AspSer195A.酶分子中的电荷中继网B.加上底物后，从Ser转移一个质子给His，带正电荷的咪唑基通过带负电荷的Asp静电相互作用被稳定.Ser195102AspHis57底物胰凝乳蛋白酶反应的详细机制（1）结合底物His57质子供体形成共价ES复合物C-N键断裂底物氨基产物释放四面体中间物的瓦解水亲核攻击羧基产物释放H2OR-NH2胰凝乳蛋白酶反应的详细机制（1）（五）天冬氨酸蛋白酶（P411-412）五、酶活性的调节控制(P413)（一）别构调控(allostericregulation)，P413酶的别构调节：酶分子的非催化部位与某些化合物可逆地非共价结合后发生构象的改变，进而改变酶的活性状态。别构调节普遍存在于生物界，许多代谢途径的关键酶利用别构调节来控制代谢途径之间的平衡。正效应物（别构激活剂）：因别构导致酶活性增加的物质。负效应物（别构抑制剂）：因别构导致酶活性减少的物质。别构酶：具有别构调节作用的酶。效应物（别构剂）：凡能使酶发生别构作用的物质。通常为小分子代谢物或辅因子。ATCase氨甲酰磷酸底物天冬氨酸底物氨甲酰天冬氨酸反馈抑制终产物CTP协同结合使得底物浓度在很小的范围内就能启动酶促反应，这种底物分子本身对别构酶的调节作用称为同促效应。激活外加ATP这种非底物分子的调节物对别构酶的调节作用称为异促效应。1.例：天冬氨酸转氨甲酰酶（ATCase）的别构调控（1）别构调控的同促和异促效应。同促效应:底物分子本身对别构酶的调节作用.异促效应:非底物分子的调节物对别构酶的调节作用.（1）别构调控的同促和异促效应（P413）:E.coli的ATCase的亚基排列c:催化亚基r:调节亚基⑵ATCase由催化亚基和调节亚基构成：用汞化物处理该酶后，ATP和CTP不能再调节酶的活性。底物结合也变的无协同性。催化亚基有三条c链，调节亚基有两条r链:3r2+2c3=r6c6c6r6复合物(3)ATCase半分子（c3r3)的结构催化位点调节结合位点催化亚基调节亚基调节亚基调节亚基P415图10-50（4）ATCase的别构作用通过四级结构大的变化来表达。PALA：是ATCase的两种底物形成的复合物的过渡态类似物。ATCasePALAATCase－PALA复合物低催化活性构象T(tense)-态CCCCCCRRRRRRCCCCCC高催化活性构象R(relax)-态RRRRRRPALAPALA(N-磷乙酰-L-天冬氨酸)结合到ATCase活性中心的模型（5）底物结合到ATCase上引起高度协同的别构转变。图10-52（6）ATP和CTP通过改变T态和R态之间的平衡来调节ATPcase的活性。ATP（正效应剂）CTP（负效应剂）低催化活性构象T(tense)-态CCCCCCRRRRRRCCCCCC高催化活性构象R(relax)-态RRRRRR2.别构酶的性质（P418）①一般都是寡聚酶，通过次级键由多亚基组成。在别构酶分子上有和底物结合催化底物的活性部位，也有和调节物或效应物结合的调节部位，这两种部位可能在同一亚基上，也可能在不同亚基上。每个别构酶分子可以有一个以上的活性部位和调节部位，因此可以结合一个以上的底物分子和调节物分子。这两个部位虽然在空间上是分开的，但这两个部位可以相互影响，通过构象的变化产生协同效应。2.别构酶的性质（P418）②别构酶的动力学：因具协同效应，故别构酶促反应[S]对V动力学曲线非双曲线，而是S形曲线(正协同)或表观双曲线(负协同)。非调节酶--负协同别构酶--正协同别构酶具有负协同效应的酶在底物浓度较低的范围内酶活力上升快，但再继续下去，底物浓度虽有较大的提高，但反应速度升高却较小。使得酶反应速度对底物浓度的变化不敏感。在正协同效应中酶反应速度对底物浓度的变化极为敏感。正、负协同别构酶与非调节酶的动力学