生物酶合成氨苄西林

固定化青霉素酰化酶合成氨苄西林的研究主要内容文献综述1实验方法23环氧基SBA-15固定化PGA合成氨苄西林亲水性溶剂中PGA/G-SBA-15合成氨苄西林环氧基磁性聚合物微球固定化PGA合成氨苄西林6PGA/G-SBA-15在双水相体系中合成氨苄西林全文总结745β－内酰胺抗生素酶法工艺化学法工艺青霉素酰化酶(penicillinGacylase,PGA)固定化方法固定化载体介孔分子筛聚合物微球共价结合法高效、高稳定性固定化PGA合成策略热力学合成动力学合成SOH+NHPenicillinGacylaseSN+H2OROOMe+NH合成酶RONHR+MeOHRCOOH+MeOH+NH2R'酯酶酰胺酶以环氧基载体共价固定化青霉素酰化酶合成β－内酰胺抗生素－氨苄西林1.根据热力学合成和动力学合成的反应特点，本实验分别采用了乙二醇－缓冲体系、有机溶剂低水量体系和双水相体系合成氨苄西林。2.采用环氧基分子筛G-SBA-15和环氧基磁性聚合物微球GMH为载体以共价固定化青霉素酰化酶，以6-氨基青霉烷酸(6-APA)和苯甘氨酸甲酯(PGME)为底物合成氨苄西林。1.红外光谱(FT-IR)2.热重－差热(TG-DTA)3.X-射线粉末衍射(XRD)4.低温N2吸附/脱附5.扫描电子显微镜(SEM)6.透射电子显微镜(TEM)7.振动样品磁强计（VSM）8.铁含量测定2.3材料表征方法2.1实验试剂2.2实验仪器2.4.2环氧基固定化酶反应原理图2-5青霉素酰化酶与环氧基载体的固定化反应2.4.3固定化酶活性的测定CHCH2O+H2NEnZEpoxysupportPGACHCH2OHH2NEnZImmobilizedPGA~30oC固定化青霉素酰化酶的酶活单位定义为：在测定条件下，每分钟催化青霉素水解生成1μmol的6-APA所需的酶量定义为一个单位(IU)。2.4固定化酶的性能测定方法图2-6硫代硫酸钠和环氧基团反应式CHCH2O+S2O32-H2O+CHCH2OHS2O3-+OH-2.5环氧基团含量测定底物和产物的检测均由高效液相色谱检测。液相色谱仪FL2200；色谱柱：VenusilXBPC184.6mm×200mm；紫外检测器：FL2200；检测波长：254nm；柱温：室温；流动相：乙酸钠缓冲溶液（50mMpH5.0）:乙睛＝88:12；进样量：10μL；流速：1mL·min-1。2.6高效液相色谱分析以及相关计算氨苄西林的合成包括三个主副反应（1）氨苄西林的合成反应（2）PGME的水解反应(PG:苯甘氨酸)（3）氨苄西林的水解反应NH2CHCOCH3ONSO+CH3COOHH2NCH36-APASynthesisCHCONHONSCH3COOHCH3Ampicillin+CH3OHPGMEImmobilizedPGANH2NH2NH2PGMEPGCHCOCH3OCHCOOH+CH3OH+H2OHydrolysisImmobilizedPGANH2NH2CHCONHONSCH3COOHCH3+CH3OHAmpicillinImmobilizedPGA+H2OHydrolysisCHCOOH+ONSCH3COOHH2NCH36-APAPG表2-46-APA、PGME和氨苄西林的标准曲线方程StandardreagentsStandardcurveequationRelativitycoefficient6-APAY=-2533+174682XR=0.99988AmpicillinY=-10438.6+363908.66667XR=0.99919PGMEY=-26386.4+108192.67206XR=0.997812.7标准溶液的配置和检测6-APA转化率（6-APAConversion）氨苄西林产率（AmpicillinYield）反应合成水解比（S/H：Morlarratioofsynthesistohydrolysis）PGME自身水解率（HR：HydrolysisRateofPGME，PG：苯甘氨酸）6-APA6-APAConversion=1006-APA反应中消耗物质的量×％反应初始物质的量AMPAmpicillinYield=1006-APA反应中生成物质的量×％反应初始物质的量S/HPG反应中生成氨苄西林物质的量＝反应中生成物质的量PGHR100PGME反应中生成物质的量＝×％反应初始物质的量分子筛水热合成SBA-15嫁接G-SBA-15PGA/G-SBA-15乙二醇（40％，V/V)-缓冲体系氨苄西林3-环氧基丙基三乙氧基硅烷（GPTS）共价结合G-SBA-15的合成以及氨苄西林合成示意图图3-1G-SBA-15的FT-IR谱图3.1G-SBA-15的结构组成及表征分析3.1.1G-SBA-15的FT-IR分析3000290014001300120011001000900800SBA-15GPTS908818G-SBA-15图3-3G-SBA-15的XRD图谱3.1.3G-SBA-15和SBA-15的XRD分析02468010203040506070802(o)SBA-15100110200G-SBA-15Intensity图3-4G-SBA-15和SBA-15的N2吸附/脱附3.1.4G-SBA-15和SBA-15的N2吸附/脱附分析0.00.20.40.60.81.00100200300400500600700RelativePressure(P/P0)VolumeAdsorbed(cm3/g)SBA-15G-SBA-15图3-5G-SBA-15和SBA-15的孔径分布024681012141618200.00.10.20.30.40.5PoreVolume(cm3/g-nm)PoreDiameter(nm)SBA-15G-SBA-15Samplesd100spacing(nm)SBET(m2/g)DPore(nm)VPore(cm3/g)We(mmol/g)SBA-159.36445.60.9550G-SBA-159.34104.80.5910.78表3-1G-SBA-15和SBA-15的结构性质3.2固定化酶PGA/G-SBA-15和PGA/SBA-15的性质SupportsEn(mg/g)AIME(IU/g)AE(IU/mg)SBA-1560.735258.64G-SBA-1570.33188326.77表3-2固定化酶PGA/G-SBA-15和PGA/SBA-15的性质3.3.1G-SBA-15环氧基团含量对氨苄西林产率的影响SamplesWe(mmol/g)Ampicillinyield(%)S/HHR(%)1.25G-SBA-150.3841.90.8322.52.25G-SBA-150.5242.60.8523.62.5G-SBA-150.7850.10.9825.13.0G-SBA-150.7850.21.0325.43.3合成氨苄西林的影响因素表3-3环氧基团含量对氨苄西林产率的影响注：2.5G-SBA-15表示加入GPTS的量为2.5mmol3.3.2反应时间的确定图3-6氨苄西林产率、S/H、HR与时间之间的关系24681005101520253035Ampicillinyield(%)S/HHR(%)Time(h)达到8h时，氨苄西林产率达最高，为35％；S/H为1.02，HR为25.0％。继续延长时间氨苄西林产率出项下降趋势，因此确定最佳反应时间为8h。Molarratio(PGME:6-APA)1:12:13:14:15:16-APAconversion(％)46.8050.5060.6787.8970.80Ampicillinyield(％)21.0426.8036.6950.2034.143.3.4底物摩尔比对合成的影响由于酯类的水溶性较差，并在较高的反应温度下易水解（酯水解为吸热反应），因此往往要加入过量的酰基供体才能达到要求的产率。3.3.6有机溶剂的影响01020304050N-butanolDMFGlycerolDMSOEthyleneglycolAmpicillinYield(%)Acetonitrile图3-9有机溶剂对氨苄西林合成产率的影响3.3.7乙二醇含量对底物和产物水解的影响图3-10(a)乙二醇含量对PGME的水解的影响(PGA/G-SBA-15)图3-11(b)乙二醇含量氨苄西林的水解的影响(PGA/G-SBA-15)010203040506018202224262830PGME(mM)Time(min)水溶液10％乙二醇20％乙二醇30％乙二醇40％乙二醇a02040608010012012141618202224AmpicillinYield(mM)Time(min)水溶液％10乙二醇％20乙二醇％30乙二醇％40乙二醇b3.3.8PGA/G-SBA-15重复使用性12345640.042.545.047.550.052.5AmpicillinYield(%)RecyclesNumber(n)图3-12PGA/G-SBA-15重复使用性3.4.1PGA/G-SBA-15合成氨苄西林ImmobilizedPGA6-APAconversion(%)Ampicillinyield(%)HR(%)S/HPGA/G-SBA-15﹡64.3671.6445.202.03PGA/G-SBA-1553.1250.2025.361.05注:﹡Highsubstrateconcentrationandsupersaturation，即高浓度体系3.4高浓度有机共溶剂体系酶促合成氨苄西林表3-5高浓度体系与乙二醇－缓冲的比较3.4.2有机溶剂对氨苄西林产率的影响OrganicsolventAmpicillinyield(%)S/HHR(%)Ethyleneglycol71.642.0345.20DMSO70.262.0040.12Glycerol65.261.8638.68DMF68.201.8835.46N-butanol55.261.3240.26Acetonitrile60.361.3834.88表3-6有机溶剂对氨苄西林合成产率的影响3.6本章小结1.G-SBA-15：良好的长程有序性，表面成功嫁接环氧基团，W环氧：0.78mmol/g，AIME：1883IU/g。2.在乙二醇－缓冲体系中最佳反应条件为4℃，pH6.3，PGA/G-SBA-15合成氨苄西林产率为50.2%，S/H为1.02，固定化酶具有良好的重复使用性。3.在高浓度体系中HR普遍较乙二醇－缓冲体系高(HR上升了20％)，这是由于底物浓度较大，使PGA/G-SBA-15向着水解底物的速率较大。有机溶剂体系PGA/G-SBA-15有机溶剂:水＝9.6:0.4氨苄西林4.1有机溶剂－低水量体系合成氨苄西林有机溶剂低水量体系合成氨苄西林示意图4.3.1有机溶剂的选择4.3反应工艺条件的优化表4-1有机溶剂对合成氨苄西林的影响OrganicsolventLogPAmpicillinYield(%)S/HHR(%)Methanol-0.77003.51Ethyleneglycol400-1.432.80.086.44Iso-butylalcohol0.874.500.332.641-propanol0.2730.251.5112.03Acetone-0.2333.241.627.96Octanol2.938.031.783.54Acetonitrile-0.441.872.662.694.3.2水含量的选择表4-2水含量对S/H的影响H2O%(v/v)AmpicillinYield(%)6-APAConversion(%)S/HHR(%)28.9012.600.310.27415.2518.321.531.11648.6949.233.151.86841.8742.442.662.691038.2540.562.406.991240.3650.282.447.831437.9644.122.