第九课电泳图谱的图像分析

电泳图谱的图像分析回顾FunctionalanalysisState1State22DEPMFMS/MSLC-MS/MSDatabasesearchDifferentialanalysis?电泳图谱的图像分析简介whatcanwegetfromimageanalysis?双向凝胶电泳技术是目前蛋白质组研究的主要技术之一,双向电泳根据等电点和分子量可一次性分离数千种蛋白质，经染色后蛋白质再PAGE上可形成密度不同、分布不均的复杂点图谱。如何有效的对双向凝胶电泳图像分析，如何对图谱上的蛋白质点进行检测、定量、比较、分析和归类，挖掘有价值的蛋白质点的信息是双向电泳分析软件所要解决的问题。PDQuest软件简介PDQuest软件是显示（imaging）、分析（analyzing）双向电泳图谱＆数据库查询的一个软件包硬件：一定的电脑配置,Pentirm166处理器，64M内存，3G硬盘，1024*768分辨率，256色，SCI接口，windows操作系统软件：PDQuest双向凝胶图像分析软件，Bio-RadLaboratory,Hercules,CAPDQuest软件的使用以PDQUEST2-D分析软件为例将双向电泳分析的基本实验过程做一简单介绍。凝胶的图像处理分析及细胞蛋白谱的建立典型流程凝胶图像的扫描：图像加工：斑点检测和定量：凝胶配比：数据分析：数据呈递（report）2-DE数据库的建立：PDQuest软件PDQUEST2-D分析软件系统和其他2-D分析软件系统一样，包括：一图象采集与加工：二斑点检测三斑点匹配四数据分析及输出PDQuest软件的使用一、图象采集与加工(editingimages)1、扫描：凝胶染色后用清华紫光扫描仪扫描，透射模式，全彩RGB,分辨率为400dpi-800dpi，尽量排除气泡，文件以tiff格式保存。2、图片加工：在PDQUEST2-D分析软件中打开以tiff格式保存的文件可以。（单击“打开文件”图标和“File”菜单并选择“Open”命令，选择保存2-D图象文件的磁盘、路径和文件名，双击文件名或单击“Open”以打开2-D图象文件，此时tiff格式保存的文件会自动另外创建一个为PDQUEST2-D分析软件自定义的文件格式2DScan。）单击工具栏上的controltheimagedisplay图标，会出现一个对话框，通过改变此对话框的High和Low的值以改变明亮度。用工具栏的crop可以切割掉凝胶边缘没有蛋白质点的部分，以减少分析的复杂性，但要注意对你要分析的多块凝胶图像最好是切割成同样大小。（在操作时先选择其中的一个凝胶图象并选定要切割的区域，然后在imageadvancecropsavecropsettings下保存crop的设定条件并输入保存的名称，其他的图象切割时在imageadvancecroploadcropsettings中选定先前保存的名称即可）二、斑点检测(spotsdetection)图象采集与加工后就要进行斑点检测，PDQUEST2-D分析软件通过一个称之为“蛋白质斑点检测向导（spotidentificationwizard）”的程序来实现的。单击“spot”菜单，选择“spotidentificationwizard”程序。该程序首先需人工设定检测参数如最小斑点、最弱斑点、最大斑点、最小斑点和背景值,然后程序进行自动检测并可调节检测的灵敏度，若检测效果不理想，该步骤可反复进行。程序允许人工调节脱尾（streaks）、背景、斑点（speckles）和其他一些选项等。这些参数设好后单击Findspotcenters,其结果在凝胶图象会显示检测到的斑点会用“字（SpotCrosshairs）”表示，检测的蛋白质斑点应尽量与肉眼观测的相符。在ParameterSet项输入保存的名称，蛋白质斑点的参数可被保存，并能用保存的参数自动检测所有2-D凝胶中蛋白质斑点，单击Processallgels，会出现一个Auto-detectspots窗口，其中可以选择需要进行斑点检测的凝胶图象（这些凝胶图像需事先打开）。蛋白质斑点检测完了之后，软件会自动创建另外两种格式分别为gelimage和gelspot。由于在进行斑点检测时会错误的识别一些蛋白质斑点，比如将一些污染的非蛋白质点识别为蛋白质点、将本来是一个蛋白质点识别为两个蛋白质点或者反之。所以在匹配之前最好进行处理，同时将gelscan、gelimage和gelspot图打开，然后单击editspottool，出现一个对话框，此对话框中有增加斑点（makeaspotatcursor）,删除斑点（removespotatcursor）,合并斑点（combinespotinbox）等图标，可根据你的目的而选择其中一个图标进行相应的斑点处理。这些处理只能在gelimage图象中处理，但相应的在gelspot图象中会同时得到显示。三、斑点匹配(Matchingspots)蛋白质斑点检测完了之后，为了比较和分析不同凝胶中蛋白质斑点的改变，PDQUEST可以建立一个Matchset。单击matchcreatmatchset,出现一个Matchset的对话框，输入文件名称，保存路径，选择（select）或上载（load）gelspot图像的文件名，然后单击creat,出现一对话框，选择其中的一个图象做为参考图象（standardmember）,整个Matchset用单个窗口（signalwindow）来表示，其中的亚窗口（subwindow）分别用来表示参考图像（用REF来表示）和成员胶（membergel）图像。Matchset建成后，接着便是设立标志点（landmark）,它的作用是对整个凝胶上蛋白质斑点进行排列（align）与定位（position）以便进行匹配（match）。单击工具栏中的matchtools图标会出现一个窗口，其中有landmark,unlandmark,matchgel,matchallgels等斑点匹配的工具,在match菜单中也有这些工具。标志点应选择分辨良好，且所有成员胶上均出现的蛋白质斑点，并尽量避开蛋白质斑点聚集的地方，最好在不同的放大倍数下确定该蛋白质斑点为所有成员胶上同一个蛋白质斑点。至少要设立两个标志点后便可利用PDQUEST的自动匹配功能来完成不同凝胶上的蛋白质斑点的匹配了。一般设立的landmark斑点个数为总斑点的10%左右，要用肉眼检查每一个应该能匹配上的斑点是否匹配上了。对错误匹配的蛋白质斑点或没有识别到的匹配可进行手工方式编辑。在这里也可以进行编辑斑点功能，单击viewinterchangeallimages,这样所有的成员胶和参考胶有Gelspot状态下变成了Gelimage,而在Gelimage状态下可进行EditSpotTools以编辑蛋白质斑点。标志点以绿色三角标记，每块胶上匹配上的蛋白质斑点以绿色字母标记，没有匹配上的蛋白质斑点用红色圈来标记，即是有无差异表达的蛋白质点。四、数据分析及输出（analysisandreport）为了分析蛋白质斑点之间差异表达，PDQUEST提供了多个分析程序，包括蛋白质斑点量(Quantity)分析，散点图工具（SatterPlotTool）,量的柱状图分析（Graph）等在内的多种分析程序。量的分析打开Matchset，单击DatabaseAnalysisCreateAnalysisSet,然后再单击参考图，就会出现一个对话框,输入名字（Name）,Type有多种选项,要做量的比较就选Quantitative。比较（Compare）形式有两种，一种是Gel,可以单个的胶两两互相比较(只能是成员胶和参考胶进行比较)，另一种是Group，可以将同一样品的多块胶做为一组（这在DatabaseReplicateGroupCreateGroup下可以创建组），然后再组之间两两比较。然后再选择A和B，分别表示两块胶或者是两组胶。ReplicateGroup在SelectSpotsWhichare中可以选择Increased,IncreasedorDecreased或者是Decreased等，激活选项后可以输入倍数关系,默认的是2times,可以输入其他数值，如3times。参数设好后就单击go,在参考胶上就会出现黄色圈标记的蛋白质斑点，如果你选择是IncreasedBA2times,那么这些黄色圈标记的蛋白质斑点即为在量上B大于A两倍的蛋白质点.为了矫正银染对蛋白质点定量分析的影响，所有点的含量通过单个点的光密度值比上胶上所有点光密度质而正常化（Normalize）,单击EditNormalize,出现一对话框，选择左上角EnableNormalize，下面的窗口被激活，在Basis下选择TotalofallValidSpots,在Scaling下选择PPM(×1000000),然后单击go。这样所有的点都正常化（Normalize）了。归一化Normalization散点图工具Scatterplot单击Reports下的Scatterplot，会出现散点图分析的对话框，可以选择x,y轴，分别代表一块胶，Markers下可以选择倍数，下面的散点图即显示了两个2-D胶图像中蛋白质点之间的相关性，上面会显示二者的相关系数，如果相关系数大于0.4，说明二者有较大的相关性，如果小于0.4大于0.2,说明相关性较小，小于0.2,说明没有相关性。在ReportsScatterplots下可以将所有的凝胶图之间的相关图都打印出来。量化柱状图Graphs单击ReportsMoreGraphsPageGraphs,在有边会出现一对化框，显示所有蛋白质点在不同胶上的量化柱状图，如果要显示所要分析的蛋白质点的量化柱状图，则在对话框的Input下选择Analysisset,出现一对话框，然后选择分析的名称即可。在ReportsQuantityGraphs下可输出所有的蛋白质点（AllMatchSpots）或者是特定分析的蛋白质点（SpecificdAnalysisSet）在不同胶上的量化柱状图。ProteomicsAnanlysisintheControlandExperimental应用材料：无腔眼金鱼胚胎正常眼金鱼胚胎差异点：量化柱状图：2DGelDatabasesBiobase角质形成细胞,膀胱癌等(丹麦CenterforGenomeResearch)ECO2DBASE大肠杆菌(在NCBI库中)Heart-2DPAGE人心肌(德国柏林)HSC-2DPAGE人类心脏(英国Harefield,HeartScienceCenter)LSB人类,小鼠和大鼠肝脏等(美国LargeScaleBiology)QUESTRef52细胞,大鼠胚胎,酵母(美国ColdSpringHarborLab)SWISS-2DPAGE十个人类图谱,包括:肝,浆细胞,红细胞,血小板,以及酵母,大肠杆菌(瑞士日内瓦,UniversityHospital)2-DE数据库YeastS.cerevisiae,S.pombe等(瑞典Got