搜索
问题：以抗虫棉为例，总结基因工程的操作步骤？基因工程的基本操作步骤目的基因的获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞操作过程目的基因的检测与鉴定目的基因主要是指______________________编码蛋白质的结构基因目的基因的获取供体生物细胞取出DNA用限制酶剪去多余部分目的基因即：将需要的基因从供体生物细胞内提取出来目前被广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、植物抗病基因（抗病毒、抗细菌)、人胰岛素基因等。在基因工程中,切割运载体和含有目的基因的DNA片段中,需使用A．同种限制酶B．两种限制酶C．同种连接酶D．两种连接酶在基因工程中，限制性内切酶主要用于A.目的基因的提取和导入B.目的基因的导入和检测C.目的基因与运载体结合和导入D.目的基因的提取和与运载体结合1）从基因文库中获取目的基因1.什么是基因文库？2.怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？种类：基因组文库：部分基因文库(cDNA文库)：获得目的基因的方法2）利用PCR技术扩增目的基因3）人工合成含有一种生物的全部基因含有一种生物的部分基因依据：目的基因的有关信息。如：根据基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色体上的位置基因的转录产物mRNA基因翻译产物蛋白质等特性①基因组文库的构建（2）.基因文库的构建方法通过对受体菌的培养而储存基因②cDNA文库的构建-----反转录法：以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。目的基因的mRNA单链DNA反转录酶DNA聚合酶双链DNA(目的基因)原核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区编码区上游编码区下游不能编码蛋白质可调控遗传信息的表达(调控序列)编码蛋白质(编码序列)原核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点RNA聚合酶是由多个肽链构成的蛋白质，能识别并与调控序列中的结合位点结合,催化转录形成RNA。与RNA聚合酶结合位点AGGUCACGUCGAGGTCACGTCGTCCAGTGCAGCRNA聚合酶RNA聚合酶RNA聚合酶真核细胞的基因结构一个典型的真核细胞基因结构示意图编码区含有能够编码蛋白质的序列(外显子)不能编码蛋白质的插入序列(内含子)真核生物的结构基因是断裂基因非编码区非编码区编码区与RNA聚合酶结合位点外显子内含子12345真核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区编码区下游调控遗传信息的表达(调控序列)外显子(能编码蛋白质)内含子(不能编码蛋白质)非编码区非编码区编码区与RNA聚合酶结合位点外显子内含子12345加工转录mRNA前体成熟mRNA加工原核细胞真核细胞不同点编码区是_____的编码区是间隔的、_____的相同点都由能够编码蛋白质的______和具有调控作用的______区组成的3、原核细胞与真核细胞的基因结构比较思考编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？连续不连续编码区非编码真核生物中编码蛋白质的基因，经转录产生有功能的成熟信使RNA的过程是•A.转录直接产生的信使RNA•B.将内含子转录部分切掉，外显子转录部分拼接起来形成•C.将外显子转录部分切掉，内含子转录部分拼接起来形成•D.ABC三种情况都有基因组文库和部分基因组文库(cDNA文库)比较PCR技术—聚合酶链式反应原理：前提：条件：PCR扩增仪DNA双链复制的基本原理一段已知目的基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸一对引物热稳定DNA聚合酶(Taq酶）DNA的两条链为模板温度控制⑤结果：使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增AAATTTGGGGCCCATCT123451234512345PCR技术扩增过程a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，断裂，形成_______b、复性（55℃-60℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的________。氢键单链DNA双链DNA链随堂闯关随堂闯关④方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循环的次数）目的基因的mRNA单链DNA(cDNA）双链DNA(即目的基因)反转录合成1）反转录法：以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列目的基因推测推测化学合成2）根据已知的氨基酸序列合成DNA法：人工合成基因表达载体的构建1.用一定的_________切割质粒，使其出现一个切口，露出____________。2.用_____________切断目的基因，使其产生_________________。——核心3.将切下的目的基因片段插入质粒的______处，再加入适量___________，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）限制酶黏性末端同一种限制酶的黏性末端切口DNA连接酶相同(二)基因表达载体的构建基因表达载体的构建——核心质粒DNA分子一个切口两个黏性末端两个切口获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种限制酶目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。科学家在培育抗虫棉时，经过了许多复杂的过程和不懈的努力，才获得成功。起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子(抗虫基因首端)，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入终止子(抗虫基因末端)，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。资料:基因表达载体的组成：目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。2、基因表达载体的组成：复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因它们各自的作用是什么?启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构②用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少④目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。注意将目的基因导入受体细胞(三)将目的基因导入受体细胞•常用的受体细胞：动植物细胞、大肠杆菌、土壤农杆菌、枯草杆菌等。•将目的基因导入受体细胞的原理：借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。转化——目的基因进入_________内，并且在受体细胞内维持_____和_____的过程受体细胞稳定表达方法导入植物细胞导入动物细胞导入微生物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法——显微注射法——感受态细胞吸收DNA分子(三)将目的基因导入受体细胞目的基因插入Ti质粒的T-DNA上农杆菌导入植物细胞整合到受体细胞的染色体上目的基因的遗传特性得以维持稳定和表达1.农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物。Ti质粒的T-DNA可转移至受体细胞的染色体上2.转化（2）基因枪法（3）花粉管通道法2、将目的基因导入动物细胞①方法：显微注射法②程序：目的基因表达载体提纯取卵（受精卵）显微注射受精卵新性状动物2.微生物作受体细胞原因：将目的基因导入微生物细胞3.转化方法：大肠杆菌繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少处理细胞→细胞→表达载体与感受态细胞混合→_________细胞吸收DNA分子。Ca2+感受态感受态1.常用菌：目的基因的检测与鉴定(四)目的基因的检测与鉴定——检查是否成功检测—鉴定—①检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因②检测目的基因是否转录出了mRNA③检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法——方法——方法——DNA分子杂交DNA分子杂交抗原-抗体杂交归纳步骤（二）、鉴定（个体生物学水平）2、检测目的基因是否转录出了mRNA3、检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等①方法:分子杂交方法:抗原抗体杂交②过程:用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA•下列技术依据DNA分子杂交原理的是()•①用DNA分子探针诊断疾病•②B淋巴细胞与骨髓瘤细胞的杂交•③快速灵敏地检测饮用水中病毒的含量•④目的基因与运载体结合形成重组DNA分子•A.②③B.①③•C.③④D.①④归纳:基因工程的基本操作程序1.获取目的基因从基因文库利用PCR化学方法人工合成2.构建基因表达载体目的基因、启动子、终止子、标记基因3.将目的基因导入受体细胞农杆菌转化法、显微注射法4.目的基因的检测与鉴定检测：是否插入、转录、翻译鉴定：1.下表关于基因工程中有关基因操作的名词及对应的内容，正确的组合是2、下列属于获取目的基因的方法的是()①利用mRNA反转录形成②从基因组文库中提取③从受体细胞中提取④利用PCR技术⑤利用DNA转录⑥人工合成A.①②③⑤B.①②⑤⑥C.①②③④D.①②④⑥随堂闯关随堂闯关3.细菌的质粒分子带有一个抗菌素抗性基因，该抗性基因在基因工程中的主要作用是A．提高受体细胞在自然环境中的耐药性B．有利于对目的基因是否导入进行检测C．增加质粒分子的分子量D．便于与外源基因连接4.有关基因工程的叙述正确的是A．限制酶只在获得目的基因时才用B．重组质粒的形成是在细胞内完成的C．质粒都可作为运载体D．蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料5.哪项不是基因表达载体的组成部分()A.启动子B.终止密码C.标记基因D.目的基因6.下列哪项不是将目的基因导入植物细胞的方法()A．基因枪法B．显微注射法C.农杆菌转化法D．花粉管通道法