2015年研究生实验2 PCR检测apoB基因多态性

实验二：PCR检测apoB基因多态性中山医学院生化教研室实验内容•1、基因PCR（已完成）；•2、鉴定apoB基因PCR产物的DNA凝胶电泳：1.5%琼脂糖凝胶浓度，100V，1h；1原理在pH8.0（碱性）的环境中DNA的磷酸基团解离，使DNA在该环境中带负电荷，在电场中向正极方向泳动，因为各种DNA分子的电荷数、分子量、构象不同，它们在通过凝胶立体网格时所受的动力和阻力不同，所以泳动的速度有差异，以此达到分离的目的。DNA显色剂多用EB，它能和碱基间的氢键结合，在紫外光照射下呈橘红色（530nm）的荧光。3一、DNA琼脂糖凝胶电泳1.1影响DNA在凝胶中迁移速率的因素•1DNA分子的大小：分子量越大，迁移速度越慢；•2构象：共价闭环DNA分子直线DNA开环双链DNA；•3凝胶浓度：浓度越大，孔径越小，DNA分子迁移越慢；•4电压：电压越高，DNA分子迁移越快；•5缓冲液：碱性环境保证DNA分子带负电荷。1.2不同浓度琼脂糖的凝胶分离范围琼脂糖浓度（％，W/V)DNA分子的有效分离范围（kb)0.70.8-100.90.5-71.20.4-61.50.2-32.00.1-22实验材料及试剂琼脂糖电泳缓冲液：1TAE（Trisacetate-EDTAbuffer）6加样缓冲液（溴酚蓝/二甲苯青/甘油）EB染色液（溴化乙锭，ethidiumbromide）琼脂糖凝胶板的制备（封板、制备1.5%的预染或未染的凝胶、倒胶、插梳、凝固后拔梳）将胶置于电泳槽（注意上样孔位于电泳槽负极一侧）倒缓冲液（没过胶约1mm）实验步骤上样紫外灯下检测（apoB基因PCR产物：双条带或单条带，700bp左右）取apoB基因PCR产物20μl上样（按学号加样：DNAmarker，样品1,样品2,样品3,样品4）apoB基因PCR产物电泳（1.5%胶，100V,1小时）1.电泳前准备准备内容作用1.刷干净电泳制胶的梳子，板子，槽子，蒸馏水洗净晾干防止不必要的重复污染，减少外来的污染。梳子干净有利于梳孔的形成。2.检查电泳槽，根据情况更换buffer排除电泳槽的电极接触不良，确保buffer的缓冲能力，减少污染。3.根据DNA的分离范围选择合适的胶浓度并记录达到较好的分离效果，防止样过快跑出胶或者是过慢浪费时间。4.计算agarose的用量和制胶buffer的用量记录，胶最终越薄越好。实验记录备查2.制胶步骤注意事项1.称量agarose和bufferBuffer不要用成H2O，称量相对准确2.融胶，加热到胶产生大量的气泡时，拿出摇匀，继续加热到完全溶解，拿出摇匀，再加热到沸腾。非常热，小心烫手，另外注意不要加热过度使胶冲出瓶子。因此注意选择起码为胶体积2倍以上的瓶子。保证胶混匀和完全溶解，减少可能因此引起的胶中孔径不均匀影响分离效果。3.倒胶，可用水浴的办法使胶冷却到60度左右，即手可以握住瓶子的温度，沿着制胶板的一侧，缓缓地一次性倒入。梳子最好是预先放好并固定的，注意梳孔的体积能点的下所有的样。用枪头赶掉气泡。制胶的桌面相对水平。倒胶时尽量减少气泡的产生。EB如果在制胶时加入，在60度左右时加入，使终浓度为0.5ug/ml。不宜过低，染色成像不明显；不宜过高，导致背景太深。摇匀要沿着瓶壁摇动，尽量减少气泡产生的可能性。高浓度胶例如2%以上的EB很难摇匀，而且凝的速度也相对快，强烈建议跑完胶之后再用EB染色。4.室温凝胶30分钟过程中不要碰到梳子，尽量保持胶的位置不移动。时间不宜过久，导致胶干燥变形；不宜过短，影响胶内部孔径形成。5.拔梳子，放入电泳槽。缓缓地将梳子垂直从梳孔拔出，尽可能使梳子是同时从各个胶孔拔出的。暂时不用的胶最好放入电泳槽电泳液中浸泡。电泳液要浸没胶1mm。3.上样电泳步骤注意事项1.样品中加入loadingbuffer使其终浓度为1X，混匀Loadingbuffer浓度不宜过低，点样时样品不能很好的沉在胶孔里；不宜过高，电泳时容易形成带形的变形。注意混匀。2.点样（每孔10ul）②apoB基因PCR产物电泳（1.5%胶，60v，2小时）沿着胶孔的边缘匀速加入。尽量避免碰坏胶孔。枪头不要吸过多的气泡，拔起时不要过猛带出样品。每点一个样完，吸取buffer洗枪头，避免样品混杂。如果是有特殊要求，例如回收，强烈建议每点一个样换一次枪头。加样的速度当然是越快越好，注意保证质量。点样的量不要太大，一方面是体积不要太大，溢出污染邻位样品；一方面不量要太大，容易导致脱尾和模糊不清。3.接通电源，选择合适的电压和时间电泳。胶孔与电极成水平状态，防止样品跑歪。跑胶期间不时回来看看，防止样品跑出胶等意外发生。4.染色成像步骤注意事项1.染色如果胶中没有加入EB，用0.5ug/ml的EB溶液浸染5-10分钟。2.调整镜头的拍摄范围和焦距，成像3.打印照片做分析记录•又称无细胞克隆技术(“freebacteria”cloningtechnique)，是一种对特定的DNA片段在体外进行快速扩增的方法。•该方法一改传统分子克隆技术的模式，不通过活细胞，操作简便，在数小时内可使几个拷贝的模板序列甚至一个DNA分子扩增107～108倍，大大提高了DNA的得率。因此，现已广泛应用到分子生物学研究的各个领域。二、聚合酶链反应或多聚酶链反应（PolymeraseChainReaction,PCR）KaryMullisPCR技术最早由美国Cetus公司人类遗传研究室KaryMullis及同事于1985年发现并研制成功的；KaryMullis因发明了“聚合酶链式反应”而获得1993年度诺贝尔化学奖。（一）原理PCR是在模板DNA、引物和四种脱氧核苷酸等存在的情况下，DNA聚合酶依赖的酶促合成反应，整个扩增过程分三步。变性：加热，模板DNA形成两条单链退火：降温，模板单链DNA与引物配对结合延伸：在DNA聚合酶及镁离子等存在的条件下，引物3’端向前延伸，合成与模板配对的新链PCR由上述高温变性、低温退火及适当温度延伸等几步反应组成一个周期，循环进行后使目的DNA得以迅速扩增。5‘3‘3‘5‘（二）PCR反应体系的组成及功能PCR的完成是在一个0.5ml的EP管中完成，一个完整的PCR反应体系应包括以下成分：1.引物2.模板DNA3.TaqDNA聚合酶4.dNTP5.10×PCR反应buffer（含镁离子）1、引物：•人工合成短寡核苷酸•是预扩增DNA片段两端的已知序列，是保证PCR特异性的关键因素，目的是提高扩增的效率与特异性。•终浓度为0.1~0.5umol/L，浓度过高易形成引物二聚体且产生非特异性产物。一般来说用低浓度引物经济、特异，但浓度过低，不足以完成30个循环的扩增反应，则会降低PCR的产率。◆设计原则：（1）引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。（2）引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。（3）引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。（4）避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。Primer本身不要出现内部互补序列,形成内部loop环二级结构,如：GGGTCGATTCCTACCCATGC注意减少Primer间互补序列,导致2个Primer形成dimer,一般不要超过3个互补bp如：CCCATGCATGGAGTC::::::::GGGTCTATCAGTAAGC（5）引物3’端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。（6）引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。修饰：如：32P、生物素、荧光素，不影响其效果突变：AGCTCCATGACCCAG5'CGCTCCATGACCCAG3'注意：绝不可以在3'端进行上述改造∵DNA聚合酶是5'→3'聚合，若3'端改造→不能互补→不能延伸（7）Primer5’未端可修饰、突变:（8）primer5’端增加碱基:引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。①内切酶识别点：（G）GAATTCGCTCCATGACCCAG↑保护bp对PCR产物cloning有很大好处②ATG起始密码③TAA、TAG、TGA终止密码如：可溶性受体的表达，无膜内区、穿膜区，只有膜外区。引物设计软件•PrimerPremier5.0（自动搜索）*•Oligo6（引物评价）•VectorNTISuit•DNAsis•Omiga•DNAstar•Primer3（在线服务）2.TaqDNA聚合酶水生栖热菌(thermusaquaticus,Taq)的DNA聚合酶，其特点有：①5’3’DNA聚合酶活性；②无3’5’外切酶活性，因此无校正功能；③有良好的热稳定性，最适聚合酶温度72℃，选择72℃延伸；④半衰期：92.5℃130min95℃40min97.5℃5—6min变性温度≤95℃，使其在整个扩增循环中保持足够活性；⑤其活性对Mg2+浓度非常敏感；⑥终浓度一般为：2.5U/100ul；3.模板DNA（1）模板用量——Plasmid:1ng,Chromosome:300-500ng,一般认为102~104拷贝模板就可以满足要求。（2）可选DNA——质粒、噬菌体、染色体DNA注意：防止交叉污染4.dNTP（1）四种脱氧核苷酸，基本原料,四种dNTP的浓度应相同，其中任何一种浓度偏高或偏低，都会诱导聚合酶的错误掺入，降低合成速度，过早终止反应（2）已有商品化的混合液，终浓度一般为20-200umol/L,高浓度dNTPs易产生错误掺入，而浓度太低，势必降低反应物的产量。注意：不稳定，保存时间长会失效5.10×PCR反应buffer(1)250~500mmol/LKCl；(2)100~500mmol/LTris-HAC(pH8.4)；(3)15~20mmol/LMgCl2（对Taq酶的活性影响很大，一般浓度为1.5~2.0mmol/L，实际应用时根据反应体系的情况进行调整）；(4)0.1%明胶或牛血清白蛋白Mg2+(1)TaqDNA聚合酶作用时需要Mg2+(2)不同的酶需不同Mg2+(3)Taq：Mg2+对反应影响很大，1-3mM终浓度外界影响：(1)EDTA鳌合Mg2+选较低浓度TE(10mMTris,1mMEDTA)；(2)DNA模板、引物和dNTP的磷酸基团均可与Mg2+结合，降低Mg2+有效浓度如果扩增产物或效率不理想，要注意调整Mg2+浓度（三）PCR反应条件1.PCR循环的温度和时间（变性、退火、延伸）2.PCR循环的次数和平台效应（1）变性温度：94-95℃Templete：GC比例高、长度很长，则变性时间↑（2）退火：温度越高，扩增特异性越好取决于引物Tm值：Tm值=4(G+C)＋2(A+T)；复性温度=Tm值-(5～10℃)，一般在45～55℃；Tm↑退火T↑，Tm↓退火T↓；若Tm较高，可使退火和延伸在同一温度（3)延伸：72℃1min/kb（10kb内）一般：40－60sec温度和时间平台效应•PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA扩增量可用Y＝(1＋X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。•反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，引物、底物的消耗、DNA聚合酶活性下降及非特异性产物的竟争等因素，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，大多数情况下，平台期(Plateauphase)的到来是不可避免的。PlateauphaseinPCRapoB基因PCR反应体系和反应步骤体系25lMix12.5l引物2lddH2O6.5l模板4