细菌内毒素方法学验证方案

生物科技有限公司确认编号：2013-014第1页共6页细菌内毒素方法学验证方案生效日期：再验证时间：生物科技有限公司确认编号：2013-014第2页共6页审批表部门姓名签名日期制定人质量管理部年月日审核人质量管理部年月日审核人辐射防护部年月日批准人质量管理部年月日1．概述细菌内毒素检查法在药品的热原限量控制中应用广泛，本方案通过对无菌氯化钠溶液、配套药盒和本公司所生产的锝[99mTc]放射性药品的细菌内毒素检测，对生产过程进行质量控制。因此对细菌内毒素检验方法的验证就显得尤为重要。2．目的为了保证所购买的无菌氯化钠溶液、配套药盒和本公司所生产的锝[99mTc]放射性药品的细菌内毒素检验方法的专属性和灵敏性，且保证检测结果可符合质量标准要求，特制定此方案。3．范围本方案适用于无菌氯化钠溶液、配套药盒以及本公司所生产的锝[99mTc]放射性药品的无菌检查方法的验证。4．确认小组成员与职责成立确认小组，明确各成员及相应职责。职务部门姓名职责组长质量管理部负责验证方案和报告的批准，指导验证项目的实施。组员质量管理部负责起草验证方案，负责验证项目的实施，协调、解决验证过程出现的问题，参与结果评价，完成验证报生物科技有限公司确认编号：2013-014第3页共6页告。组员质量管理部参与验证项目实施的具体工作，收集、整理验证所需文件，完成测试、检验记录和复核记录的填写。组员质量管理部负责验证方案和报告审核，参与完成验证项目的实施，验证总结和结果评价的会签。组员辐射防护部监督整个验证项目的实施，保证实施过程的安全性。5．参考文件5.1确认与验证管理规程5.2《中国药典》2010年版二部附录XIE6．验证所需仪器和材料6．1验证中所用到的仪器：电子天平、电热干燥箱、恒温水浴箱、水银温度计和旋涡混合器，验证所涉及到的仪器均经过检定或确认合格，且在有效期内。6．2验证所需试剂：具有国家主管部门的批准文号的鲎试剂和由中国药品生物制品检定所统一发放的细菌内毒素工作标准品。7.验证标准在实验结果中，必须要阳性对照都为阳性、供试品阳性对照都为阳性且阴性对照都为阴性时，实验有效。8.验证步骤8.1实验前准备验证前首先要进行细菌内毒素标准品的制备，内毒素限值的确定。然后确认鲎试剂是否进行灵敏度复核和干扰试验。确定干扰试验中的最大稀释倍数（MVD）。8.1.1根据2010年版中国药典二部附录ⅪE细菌内毒素检查法中规定，细菌内毒素限值计算公式：L=K/M式中L为供试品的细菌内毒素限值，本品以EU/mg表示；K为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，注射剂K=5EU/（kg．h）；生物科技有限公司确认编号：2013-014第4页共6页M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，人均体重按60kg计算，人体表面积按1.62m2计算。注射时间若不足1小时，按1小时计算。本品以腺苷蛋氨酸计最大剂量为1000mg。L=5EU/（kg．h）*60kg*1h/1000mg=0.3EU/mg因此本品的细菌内毒素限值为0.3EU/mg。8.2.2确定最大有效稀释倍数（MVD）样品溶液的制备：取注射用********适量（约相当于含腺苷蛋氨酸500mg）加入注射用溶剂5ml，再用细菌内毒素检查用水稀释至每1ml含腺苷蛋氨酸10mg的溶液。本品内毒素限值为0.3EU/mg。MVD=cL/λL=0.3EU/mlc=10mg/mlλ1=0.5EU/ml，λ2=0.25EU/ml因此MVD1=6，MVD2=128.1.3细菌内毒素标准溶液的制备取细菌内毒素工作标准品一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，然后用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开，启开过程中应防止玻璃屑落入瓶内。按照标准品说明书，加入规定量的细菌内毒素检查用水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严，置旋涡混合器上混合15分钟。然后进行稀释，制备成4个浓度的细菌内毒素标准溶液，即2λ、1λ、0.5λ、0.25λ（λ为所复核的鲎试对的标示灵敏度），每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒钟。8.2细菌内毒素检查在细菌内毒素检查中，每批供试品必须做2支供试品管和2支供试品阳性对照，同时每次实验必须做2支阳性对照和2支阴性对照。8.2.1.操作方法8.2.1.1制备内毒素标准对照溶液取1支细菌内毒素标准品，用细菌内毒素检查用水稀释成4个浓度的标准溶液即2λ、1λ、0.5λ、0.25λ（方法同8.1.3）。8.2.1.2.供试品溶液的制备：（稀释倍数不得超过MVD）取注射用********加入注射用溶剂并制成每1ml含腺苷蛋氨酸10mg的溶液，再根据MVD加入细菌内毒素检查用水稀释，再用此稀释液将8.2.1.1中的同支细菌内毒素生物科技有限公司确认编号：2013-014第5页共6页标准品稀释成4个浓度即2λ、λ、0.5λ、0.25λ的含内毒素的供试品溶液。8.2.1.3.阳性对照溶液的制备用检查用水将内毒素标准品稀释制成2λ浓度的内毒素标准溶液（方法同8.2.1.1.）。8.2.1.4.供试品阳性对照溶液的制备用待检测的供试品溶液或其稀释液将内毒素标准品制成2λ浓度的内毒素溶液。（方法同8.2.1.3.供试品阳性对照溶液的制备）。8.2.1.5.阴性对照液用细菌内毒素检查用水8.2.1.6.鲎试剂的准备取规格为0.1ml/支的鲎试剂8支，轻弹瓶壁使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内。每支加入0.1ml检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。8.2.1.7.加样取8支（管）溶解好的鲎试剂，其中2支加入0.1ml供试品溶液或其稀释液（其稀释倍数不得超过MVD）作为供试品管，2支加入0.1ml阳性对照溶液作为阳性对照管（PC），2支加入0.1ml检查用水作为阴性对照管（NC），2支加入0.1ml供试品阳性对照溶液作为供试品阳性对照管（PPC）。8.2.1.8.将试管中溶液轻轻混匀后，用封口膜封闭管口，垂直放入37℃±1℃水浴或适宜恒温器中，保温60±2分钟。保温和取放试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。8.2.2.结果判断8.2.2.1.判断标准当阳性对照都为阳性、供试品阳性对照都为阳性且阴性对照都为阴性时，实验有效。若供试品2管均为阴性，认为该供试品符合规定；如供试品2管均为阳性，应认为不符合规定；如2管中1管为阳性，1管为阴性，按上述方法另取4支供试品管复试，4管中如有1管为阳性，即认为不符合规定。若第一次实验时供试品的稀释倍数小于MVD而结果出现2管均为阳性或2管中1管为阳性时，按同样方法复试，复试时要求将其稀释至MVD。8.2.2.2.判断结果：（记录附后）生物科技有限公司确认编号：2013-014第6页共6页9.确认总结对每一项测试结果均应有记录和签名，并与相应标准做比较，最后给出合格与否的结论。10．质量保证：质量保证员对验证过程进行复核并签名，以证明该验证方案已被执行，从而说明细菌内毒素检验符合生产要求。11．背离标准的处理在验证过程中，若与标准存在偏差、例外等情况时，都要作好相应的记录。对于超出标准规定误差的，则应填写记录并制定纠错方案，任何对背离标准所采取的纠正措施都必须经质量管理部经理的批准。12．验证报告12．1验证目的。12．2验证范围。12．3验证记录。12．4验证情况综述。12．5验证结果。12．6偏差及异常处理措施。12．7评价及建议。12．8验证结论及再验证时间。12．9验证报告的审核和批准：验证报告由质量保证员审核签字，质量管理部经理批准签字。12．10验证报告经审核批准后，归档保存。