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第15章干细胞鲨鱼之齿1.锋利：其咬食压力每平方英寸高达18吨。2.多排：具有5—6排，最外排牙齿真正起到牙齿的功能，其余备用，一旦在最外一层的牙齿发生脱落时，里面一排的牙齿马上就会向前面移动，用来补足取代脱落牙齿的空穴位置。3.形状各异：如剃刀，可以用来切割食物；成锯齿状，可以用来撕扯食物；呈扁平臼状，可以用来压碎食物外壳和骨头等。4.再生：鲨鱼的牙齿可以无限制的增长和再生。据统计，一条鲨鱼，在10年以内竟要换掉2万余只牙齿。骨髓移植骨髓移植(Bonemarrowtransplantation)是各种血液肿瘤（白血病、恶性淋巴瘤）、再生不良性贫血症、重度地中海型贫血症以及一些先天性免疫缺乏症或代谢性疾病救命的根本治疗方法。骨髓干细胞通过分化生成各种血细胞如红细胞、白细胞、血小板、淋巴细胞等。因此，骨髓对于维持机体的生命和免疫力非常重要。脐带血库脐带血移植效果优于骨髓：其干细胞含量更多，且较有可塑性，即使不是完全吻合，也可以移植到病患体内，而骨髓移植就需要完全吻合。2007年《Pediatrics》报道：2004年美国一三岁女孩突患急性淋巴细胞性白血病。她以出生时保存的自体脐带血造血干细胞进行了移植救治。儿童白血病自体脐血成功移植的全球首例。自1995年起，全世界已有40多个国家设立了各种性质的脐带血血库。一、定义干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。二、分类不同的干细胞具有不同的分化潜能。从所具有的分化功能上讲，可分为单能干细胞、多能干细胞与全能干细胞。从来源上讲，干细胞包括成体干细胞和胚胎干细胞。15.1干细胞二、干细胞的生物学特征自我更新特征：通过两种方式生长：一种是对称分裂，形成两个相同的干细胞；另一种是非对称分裂，一个保持亲代细胞的特征，另一个走向分化的终端成为功能专一的分化细胞增殖特征：慢周期性：绝大多数细胞处于G0期自稳性：通过自我更新维持自身数目的稳定分化特征：能够产生至少一种类型的高度分化的子代细胞。干细胞的功能为控制和维持细胞的再生。15.1干细胞胚胎干细胞与成体干细胞来源分化潜能端粒酶的活性不同一、基本概念胚胎干细胞简称ES细胞，它是从着床前胚胎内细胞团或原始生殖细胞经体外分化抑制培养分离的一种全能性细胞系，可以分化成任何一种组织类型的细胞。15.2胚胎干细胞一、概念胚胎干细胞:是从着床前胚胎内细胞团或原始生殖细胞经体外分化抑制培养分离的一种全能性细胞。15.2胚胎干细胞人类胚胎二、胚胎干细胞的特征形态特征体积小、核大，有一个或多个核仁；胚胎干细胞克隆紧密堆积，无明显的界限，形似鸟巢。生化特征碱性磷酸酶呈强阳性；端粒酶活性高，具有长的端粒；表达早期胚胎细胞的阶段特异性抗原。遗传学特征染色体数目与核型与来源细胞保持一致。胚胎干细胞在体外不断增殖且维持遗传的稳定性（正常的核型及端粒的长度）15.2胚胎干细胞三、胚胎干细胞分离来源：囊胚期胚胎的内细胞团(→ES细胞)（主要途径）；原始生殖细胞(→EG细胞)；胚胎瘤细胞(→EC细胞)15.2胚胎干细胞四、胚胎干细胞的鉴定碱性磷酸酶活性：未分化的胚胎细胞中含有丰富的碱性磷酸酶，活性很高；而已经分化的胚胎干细胞中碱性磷酸酶呈现弱阳性或阴性。端粒酶活性：胚胎干细胞有着高水平的端粒酶活性，并具有长的端粒。干细胞标记物：胚胎干细胞为未分化细胞，能表达早期胚胎细胞的阶段特异性胚胎抗原（SSEA）。15.2胚胎干细胞五、胚胎干细胞体外培养须满足三个要求维持细胞增殖的能力维持正常二倍体核型维持细胞末分化状态15.2胚胎干细胞（一）培养基与消化液培养基：DMEM（高糖）+谷氨酰胺+15%胎牛血清+β-巯基乙醇消化液：较高浓度的胰蛋白酶和EDTA（二）饲养层细胞：主要应用鼠胚原代成纤维细胞（PMEF）小鼠胚胎成纤维细胞(STO)细胞作为饲养层细胞。饲养层细胞作用有二：提供物理支持；分泌促进胚胎干细胞增生的成纤维生长因子（FGF）和抑制胚胎干细胞自主分化的白血病抑制因子（LIF）。五、胚胎干细胞体外培养生长在饲养层上的ES细胞（三）条件培养基与细胞因子无饲养层细胞：基础培养基加入LIF、bFGF、干细胞因子制备成条件培养基。保证胚胎干细胞增殖的同时维持未分化的二倍体状态。五、胚胎干细胞体外培养（四）胚胎干细胞体外培养的步骤（流程）①内细胞团获得：从着床前胚胎或体外培养的早期胚胎分离内细胞团,经消化并分散细胞团。②原代培养：将内细胞团细胞接种在饲养层细胞上培养。③传代培养：采用胰蛋白酶消化，选择未分化克隆接种于新的饲养层上或条件培养基中进行分化抑制培养。④干细胞鉴定与分化潜能评价五、胚胎干细胞体外培养（一）诱导分化方法1）细胞因子诱导法2）选择性标记基因筛选目的细胞法3）特异性转录因子异位表达法六、胚胎干细胞体外诱导分化（二）可能的应用1、组织或器官修复胚胎干细胞最激动人心的潜在应用是用来修复甚至替换丧失功能的组织和器官，因为它具有发育分化为所有类型组织细胞的能力。任何涉及丧失正常细胞的疾病都可以通过移植由胚胎干细胞分化而来的特异组织细胞来治疗。2、基因治疗干细胞是基因治疗的较理想的靶细胞，因为它可以自我复制更新，治疗基因通过它带入人体中，能够持久地发挥作用。而不必担心像分化的细胞那样，在细胞更新中可能丢失治疗基因。（四）存在问题如何维持胚胎干细胞未分化状态的机制虽然人胚胎干细胞可以形成各种类型的细胞和简单的组织，但是其是否具有形成复杂器官的能力目前还远未清楚。来源于胚胎干细胞的细胞应用于细胞和组织替代治疗所面临的移植排斥问题干细胞用于临床治疗的安全性问题，对于胚胎干细胞而言，在移植前应该保证胚胎干细胞全部被诱导分化，对诱导分化的细胞应该严格纯化一、概念与特点概念：成体干细胞是是成体组织内具有更新和进一步分化潜能的细胞二、基本特点为多能或单能干细胞存在于机体的各种组织器官中，数量少。能够自我更新并且能够分化形成组成该类型组织的细胞。体外培养时不能长时间增殖。具有可塑性。15.3成体干细胞二、具体应用举例神经干细胞理论上讲，任何一种中枢神经系统疾病都可归结为神经干细胞功能的紊乱。给帕金森氏综合症患者的脑内移植含有多巴胺生成细胞的神经干细胞，可治愈部分患者症状。神经干细胞治疗阿尔茨海默病和亨顿舞蹈病。15.3成体干细胞造血干细胞造血干细胞是体内各种血细胞的唯一来源，它主要存在于骨髓、脐带血中。造血干细胞的移植是治疗血液系统疾病、先天性遗传疾病以及多发性和转移性恶性肿瘤疾病的有效方法。间充质干细胞（MSC）存在于骨髓中，是一群具有向骨、软骨、肌肉及肌腱、韧带、脂肪、和血管内皮、肝、神经、皮肤等多种组织分化潜能的性质均一的细胞.MSC可用为组织工程的首选“种子”细胞：取材方便，对机体无害；取自自体，不存在组织配型及免疫排斥；体外能很好地扩增；分化的组织类型广泛。MSC是基因治疗的理想的靶细胞：易于获得，并具有体外长期培养的遗传的稳定性和可移植性；外源基因易于植入，并或整合到MSC的基因组中稳定表达面不影响其干细胞特性；三、问题分析成体干细胞优点（1）来源方便：可以从自身获得。（2）没有伦理学问题：成体干细胞来自成熟个体，不会损伤供体。（3）避免免疫排斥反应：同种异体胚胎干细胞及其分化细胞用于临床会引起免疫排斥。采取自身供体细胞核通过治疗性克隆可以得到自身胚胎干细胞。（4）比较安全：虽然胚胎干细胞能分化成各种细胞类型，但目前还不能完全控制胚胎干细胞的定向分化，容易导致畸胎瘤。相对而言，成体干细胞比较安全。问题（1）成体干细胞在组织中含量极少，又缺乏特异性检测标志，很难从组织中分离纯化出来。（2）成体干细胞的可塑性机制还不清楚。（3）有待建立有效的使成体干细胞在体外增殖而又能维持未分化状态的技术。（4）成体干细胞体外长期传代后会发生表型的改变，且成体干细胞也参与肿瘤的形成。干细胞美容：世界在试验中国已疯狂“科技部门奋力抢跑‘鼓励干’，卫生部门紧闭双眼‘不让干’，药监部门眼盯美国‘看着干’，学者专家崇尚信仰‘大胆干’，企业老板趋利避害‘晕着干’，医疗机构追名逐利‘偷着干’，美容机构胡说八道‘忽悠干’，数万患者被做白鼠‘花钱干’。”在今年全国两会的提案中，冯世良引用一首打油诗，呼吁加强对干细胞产业乱局的规范刻不容缓。