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1第十一章染色体制备及显带技术（样张）撰写思路：1．本章的总体介绍要求（800-1000字）（1）该技术历史沿革和背景概述该技术发明或发现至今重大进展时间和人物（2）该技术主要应用和特点概述应用：检验科或细胞遗传实验室用于染色体病的诊断、出生缺陷产前诊断特点：人工操作；需要技巧和经验；不同标本制备的难易程度相差较大（3）该技术的发展前景复杂性疾病的遗传背景流行病学调查、相关疾病基因定位研究2．每节内容要求（500字）（1）该技术基本原理的概述促进细胞分裂；中期细胞的获得；相关处理保证染色体形态的规整。（2）该技术的主要应用概述某些疾病状态的组织细胞和发育过程中的胚胎细胞染色体会出现与个体其他细胞不同的现象，说明用不同组织细胞制备染色体的意义（为后续实验项目作铺垫）。3．实验项目内容的要求（1）阐述实验设计的思路及目的血液标本采集方便；血液中有核细胞能代表个体核型；有核细胞中淋巴细胞具有转化为增殖细胞的能力；通过把细胞阻断在中期以获得更多的中期细胞；通过低渗和固定处理保证染色体分散和形态的规整。（2）本实验项目的基本原理阐明促进细胞分裂；中期细胞的获得；相关处理保证染色体形态的规整具体实施方法。（3）主要器械和试剂（4）实验操作步骤及结果用简明清晰的线条图描述操作步骤及结果。（5）实验注意事项实验操作中容易出现问题的关键步骤进行说明。2（6）讨论与思考：A．思考题（临床意义，操作中的难点、重点）。B．检测同一种物质不同方法的比较。C．各种实验结果的数据库（光盘），学生课外对各种实验结果出现的原因进行分析和判断。4．实验项目的选择原则（1）临床实验室常用、通用技术，临床上可直接应用和为临床检测方法奠定基础。（2）科研实验室通用技术，为从事实验室研究和研究生实验打下基础（3）临床实验室和科研实验室具有应用前景的项目3染色体（chromosome）是遗传物质DNA在细胞分裂期存在的一种形式，由于其容易被碱性染料所着色，Waldayer在1888年将它正式命名为染色体。1912年，Winiwarter等才开始进行人类染色体研究，但由于受到制备技术的限制，制备的标本常出现染色体聚集和缠绕在一起的现象，难以对人类染色体进行准确的计数和分析。直到1952年美籍华人徐道觉教授首次通过细胞的低渗处理技术，改变了以往染色体聚集在一起不易识别的状况，为人类染色体形态分类的国际统一标准化打下了基础。1956年随着培养和制备技术的改进，Tjio和Lenen首次通过流产胎儿肺组织培养确认了人类染色体的正确数目和形态，肯定了人类染色体数目为46条，其中44条（22对）为常染色体（autosome），2条为性染色体（sexchromosome），男性和女性性染色体分别为XY和XX。人类染色体的分类标准首次在1960年丹佛会议上提出，在此基础上经多次补充和改进，编辑了《人类细胞遗传学命名国际体制（AnInternationalSystemforCytogeneticNomenclature，ISCN）。从此，人类染色体分类具有了统一的国际标准，而目前临床遗传学界普遍使用最新的ISCN(2005)是包括1960年丹佛、1963年伦敦、1966年芝加哥、1971年巴黎及ISCN(1978)、ISCN(1981)、ISCN(1985)、ISCN(1995)等多次人类染色体国际命名委员会会议的所有决议内容所制定的人类染色体分类的国际标准，该标准对染色体分组、不同显带方法的染色体带纹分布特点和染色体畸变的描述符号进行了详尽的记述。染色体制备技术目前已广泛应用于各大医院的检验科或细胞遗传实验室，是染色体病的诊断、出生缺陷产前诊断的必备手段。染色体制备的整个过程以人工操作为主，且需要具备一定的操作技巧和经验，其技术本身已相当成熟，但针对不同的临床组织标本染色体制备的难易程度相差较大。在高质量的染色体标本的基础上，利用荧光原位杂交技术（FISH）开展分子细胞遗传学诊断和研究是近年来发展的一个重要趋势，在许多复杂性疾病的遗传背景流行病学调查、相关疾病基因定位研究等方面具有重要的运用前景。4第一节染色体制备技术尽管染色体被认为是生物物种的一种永恒的标志，既同一物种体内不同类型细胞内的染色体数目、形态和大小都是恒定的，但在临床上某些疾病状态的组织细胞和发育过程中的胚胎细胞染色体会出现与个体其他细胞不同的现象，在临床诊断中具有十分重要的价值。外周血淋巴细胞、绒毛细胞、羊水细胞、骨髓细胞等是几种临床上常用的染色体标本制备技术。人类所有有核细胞（含体细胞和生殖细胞）都可以用以制备染色体，但由于染色体仅存在于分裂期，而人体内绝大多数细胞在绝大多数时间都处于细胞周期的间期，因此，获得更多的处于分裂期细胞就成为了成功制备染色体标本最重要的先决条件。其次，细胞分裂中期是染色体螺旋化程度最高，形态特征最容易鉴别的时期，制备染色体标本前获得大量的中期细胞是制备高质量染色体标本的重要前提。再次，对提取的中期细胞染色体进行的一系列处理是保证染色体具有良好的分散程度、清晰易辨形态的关键环节。5实验一人类外周血淋巴细胞染色体标本制备一．实验设计及目的1、外周血具有标本采集方便的优势、又具有代表该个体体细胞染色体特征的特性。2、外周血中仅有白细胞为有核细胞，方能用于染色体标本的制备。3、外周血中绝大多数的白细胞为高度分化的细胞，处于细胞间期，其中淋巴细胞具有转化为原始的增殖细胞的能力。4、通过一系列处理保证染色体分散程度恰当、无扭曲、形态规整，便于识别。5、要求掌握加入PHA、低渗、固定在染色体制备中的主要作用，熟悉操作的基本过程，了解染色体不分散、染色体形态不规整、染色体偏长或过于短小的原因。二．实验原理人外周血淋巴细胞几乎都处于细胞周期的间期(G1或G0期)，一般情况下都不进行分裂。植物凝集素（PHA）和刀豆素等具有较强的促进淋巴细胞转化为淋巴母细胞的作用，淋巴母细胞具有较强的细胞分裂能力。通过秋水仙碱类药物（包括秋水仙素和秋水仙胺两大类）对培养细胞进行处理，使细胞中期纺锤体微管形成受阻，细胞分裂终止于中期，以便获得更多的中期分裂相用于染色体分析。细胞内空间十分有限，中期染色体常凝集和缠绕在一起，通过低渗处理可促进染色体分散。利用甲醇、冰醋酸配制的固定液处理可保证染色体形态更规整。最后将含固定液的细胞悬液滴至冰载玻片上并在火焰上立即适当加温，充分利用热胀冷缩、机械震动和固定液分子快速蒸发形成的张力促使细胞膜破裂，实现一个细胞内染色体在载玻片上适当的区域内散开，既便于分析又可以最大限度的避免染色体丢失。三．主要器械和试剂器械：离心机、培养箱、培养瓶(25ml园瓶)、吸管、离心管（5ml）试剂：0.075MKCl、固定液（甲醇和冰醋酸各75%和25%混均，使用时临时配置）、培养液（4ml/瓶，-20℃保存，接种时37℃解冻、0.2ml抗凝血/瓶）四．实验操作步骤及结果6五．注意事项1、肝素使用量偏少和偏多会分别引起细胞凝集和溶血，直接影响细胞分裂。2、PHA使用量偏少会导致淋巴细胞转化为淋巴母细胞的数量减少、分裂期细胞数量减少，使用偏多又会引起细胞凝集直接影响细胞分裂。六．讨论与思考1．思考题（临床意义，操作中的难点、重点）2．各种染色体标本图片（光盘）染色体分散程度不好，低渗处理不够染色体严重丢失，滴片时操作不当