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1.2基因工程的基本操作程序2020/3/31原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游与RNA聚合酶结合位点启动子终止子编码区：能转录，编码蛋白质非编码区：不编码蛋白质,能调控遗传信息表达2020/3/32真核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区启动子终止子编码区上游编码区下游内含子外显子与RNA聚合酶结合位点编码区：非编码区：外显子：内含子：能编码蛋白质的序列不能编码蛋白质的序列2020/3/33非编码区非编码区编码区RNA聚合酶结合位点外显子内含子终止子启动子原核真核基因的结构2020/3/34原核细胞真核细胞不同点编码区是_____的编码区是间隔的、_____的相同点都由能够编码蛋白质的______和具有调控作用的______区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较思考编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？连续不连续编码区非编码2020/3/35山西省孝义市第二中学基因工程的基本操作程序目的基因的获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞操作过程目的基因的检测与鉴定2020/3/362020/3/37目的基因主要是指______________________编码蛋白质的基因目的基因的获取供体生物细胞取出DNA用限制酶剪去多余部分目的基因即：将需要的基因从供体生物细胞内提取出来目前被广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、植物抗病基因（抗病毒、抗细菌)、人胰岛素基因等。也可以是一些具有调控作用的因子2020/3/38获得目的基因的方法从基因文库中获取目的基因1.什么是基因文库？2.怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？种类：基因组文库：部分基因文库：(如cDNA文库)基因的核苷酸序列等利用PCR技术扩增目的基因人工合成含有一种生物的全部基因含有一种生物的部分基因根据基因的有关信息：如基因的转录产物mRNA未知序列基因较小已知序列已知序列2020/3/391.用一定的_________切割质粒，使其出现一个切口，露出____________。2.用_____________切断目的基因，使其产生_________________。——核心3.将切下的目的基因片段插入质粒的______处，再加入适量___________，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）限制酶黏性末端同一种限制酶的黏性末端切口DNA连接酶相同(二)基因表达载体的构建2020/3/310质粒DNA分子限制酶处理一个切口两个黏性末端两个切口获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）——核心同一种(二)基因表达载体的构建4.过程:2020/3/311科学家在培育抗虫棉时，经过了许多复杂的过程和不懈的努力，才获得成功。起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子(抗虫基因首端)，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入终止子(抗虫基因末端)，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。资料:2020/3/312基因表达载体的组成：目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。a、目的基因b、启动子c、终止子d、标记基因2020/3/313(三)将目的基因导入受体细胞•常用的受体细胞：动植物细胞、大肠杆菌、土壤农杆菌、枯草杆菌等。•将目的基因导入受体细胞的原理：借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。转化——目的基因进入_________内，并且在受体细胞内维持_____和_____的过程受体细胞稳定表达2020/3/314方法导入植物细胞导入动物细胞导入微生物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法——显微注射法——感受态细胞吸收DNA分子(三)将目的基因导入受体细胞2020/3/315(四)目的基因的检测与鉴定——检查是否成功检测—鉴定—①检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因②检测目的基因是否转录出了mRNA③检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法——方法——方法——DNA分子杂交分子杂交抗原-抗体杂交2020/3/316①直接分离法:用限制酶切成许多片断2.构建基因文库将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。2020/3/317①直接分离法：供体细胞中的DNA许多DNA片段运载体限制酶分别与载体连接受体细胞分别导入2.构建基因文库2020/3/318mRNA反转录cDNA(互补DNA）DNA聚合酶双链DNA②反转录法：2.构建基因文库2020/3/319cDNA合成过程•第一步，反转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA单链，形成RNA-DNA杂交分子。•第二步，核酸酶H使RNA-DNA杂交分子中的RNA链降解，使之变成单链的DNA。•第三步，以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。2020/3/320基因组文库：一般针对原核生物的基因，因为基因少部分基因文库：一般针对真核生物的基因，如cDNA文库文库类型cDNA文库基因组文库文库大小小大基因中启动子无有基因中内含子无有基因多少某种生物的部分基因某种生物的全部基因物种之间的基因交流可以部分基因可以说明基因文库的组建过程就包含基因工程的基本操作步骤。从基因文库中获取目的基因的优点是操作简便，缺点是工作量大，具有一定的盲目性.基因文库的构建方法2020/3/321依据：目的基因的有关信息。如：根据基因的核苷酸序列基因的功能、基因在染色体上的位置基因的转录产物mRNA基因的表达产物蛋白质等特性。3．如何从基因文库中得到所需要的基因？2020/3/322利用PCR技术扩增目的基因原理:DNA双链复制前提:要有一段已知目的基因的脱氧核苷酸序列，以便合成引物。2020/3/323①概念：PCR全称为_______________，是一项在生物____复制___________的核酸合成技术③条件：_______________________、_______________、___________、___________.前提条件：②原理：__________④方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循环的次数）⑤结果：选修1P60聚合酶链式反应体外特定DNA片段DNA双链复制已知基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸一对引物DNA聚合酶指数2n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增利用PCR技术扩增目的基因2020/3/324⑥过程：a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，_____断裂，形成___________b、退火（复性55℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的________。氢键单链DNA双链DNA链2020/3/3252020/3/326利用PCR技术扩增目的基因2020/3/327山西省孝义市第二中学PCR技术扩增过程a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，断裂，形成_______b、复性（55℃-60℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的________。氢键单链DNA双链DNA链随堂闯关随堂闯关2020/3/328PCR技术DNA复制过程DNA变性（90～95℃）→退火（复性55~60℃）→子链延伸（70~75℃）→重复循环DNA复制起始，RNA引物形成→DNA片段生成→RNA引物水解→完整的DNA分子形成相同点原则碱基互补配对条件模板、原料（dCTP、dATP、dGTP、dTTP）、能量、酶、引物等不同点解旋方式氢键在高温下断裂，双链全部解开解旋酶催化氢键逐步断裂场所体外主要在细胞核中引物DNARNA酶热稳定DNA聚合酶（Taq酶）解旋酶、DNA聚合酶、DNA连接酶等结果在短时间内形成大量的DNA片段形成完整的DNA分子利用PCR技术扩增目的基因2020/3/329目的基因的mRNA单链DNA(cDNA）双链DNA(即目的基因)反转录合成1）反转录法：以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列目的基因推测推测化学合成2）根据已知的氨基酸序列合成DNA法：2020/3/3302.微生物作受体细胞原因：将目的基因导入微生物细胞3.转化方法：大肠杆菌繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少处理细胞→细胞→表达载体与感受态细胞混合→_________细胞吸收DNA分子。Ca2+感受态感受态1.常用菌：2020/3/331目的基因插入Ti质粒的T-DNA上农杆菌导入植物细胞整合到受体细胞的染色体上目的基因的遗传特性得以维持稳定和表达1.农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物。Ti质粒的T-DNA可转移至受体细胞的染色体上2.转化2020/3/3322020/3/333如果显示出杂交带，就表明待测样品含有目的基因或目的基因已经转录。2020/3/334细胞类型常用方法受体细胞转化过程植物细胞农杆菌转化法体细胞将目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→转入农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的DNA动物细胞显微注射技术受精卵将含有目的基因的表达载体提纯→取卵→受精卵→显微注射→早期胚胎培养→胚胎移植→发育成为具有新性状的动物微生物细胞Ca2+处理法原核细胞用Ca2+处理细胞→感受态细胞→重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子将目的基因导入受体的方法2020/3/335目的基因的检测与鉴定检测步骤目的方法原理工具现象1DNA分子杂交技术碱基互补配对放射性同位素作标记的含目的基因的DNA片段杂交带2检测目的基因是否转录出了mRNADNA分子杂交技术碱基互补配对放射性同位素作标记的含目的基因的DNA片段杂交带3检测目的基因是否翻译成蛋白质抗原-抗体杂交抗体的专一性特定抗体杂交带(阳性反应)检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因2020/3/336寻根问底——为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗？提示：构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是惟一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过PCR方式从含有该基因的生物的DNA中，直接获得，也可以通过反转录，用PCR方式从mRNA中获得，不一定要构建基因文库。但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。2020/3/337寻根问底：将目的基因直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，结果会怎样？提示：有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将一个生物中的总DNA提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，没有进行表达载体的构建，这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定什么基因导入了受体植物。此法目前争议颇多，严格来讲不算基因工程。2020/3/338思考与探究：1.作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：（1）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；（2）通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；2020/3/33