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基因工程设想一能否让水稻植株也能够固定空气中的氮？能否让细菌“吐出”蚕丝？设想二能否让微生物产生出人的胰岛素、干扰素等珍贵的药物？设想三……▲“基因工程”技术即根据人类的意愿定向改变生物---令人神往!•基因工程培育抗虫棉的简要过程：普通棉花(无抗虫特性)苏云金芽孢杆菌获取抗虫基因（目的基因）与运载体DNA拼接导入棉花细胞(含抗虫基因)棉花植株(有抗虫特性)▲基因工程实例:•什么叫基因工程？基因工程是指按照人们的愿望,进行严格的设计,并通过在生物体外进行DNA重组等技术，赋予生物以新的遗传特性,从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的,因此又叫做DNA重组技术或基因拼接技术.（一）基因工程的概念基因工程的别名操作环境操作对象操作水平基本过程实质结果基因拼接技术或DNA重组技术生物体外基因DNA分子水平人们需要的新的生物类型和生物产品切割→拼接→导入→表达基因重组▲基因工程的若干问题:DNA重组技术(基因工程)的基本工具做工程是需要工具的.•前面介绍的利用基因工程培育抗虫棉的主要步骤有哪几个?步骤一：从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来抗虫基因(目的基因).步骤二：抗虫基因与运载体DNA连接步骤三：抗虫基因导入受体(普通棉花)细胞▲思考:提示:共四步;步骤四是“检测和鉴定”.▲上述的三个步骤中各需要什么工具？步骤一的工具：步骤二的工具：步骤三的工具：“分子手术刀”——限制性内切酶“分子缝合针”——DNA连接酶“分子运载车”——载体▲这里的“分子”是指__________________分子.DNA(目的基因、载体)▲这三种工具的作用各是什么?1.限制性核酸内切酶——“分子手术刀”限制酶主要是从原核微生物中分离纯化出来的。能识别双链DNA的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间(此处叫“切点”)的磷酸二酯键断开(注意:不是氢键).（二）DNA重组技术的基本工具及其作用注意:一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列,并且能在一个特定的切点上切割DNA分子。即：特异性.(注意:特异性表现在两个方面.)AATTGCCTTAAGDNA双链及“磷酸二酯键”磷酸二酯键1.大肠杆菌(EcoRΙ)的一种限制酶能识别的脱氧核苷酸序列是(用碱基表示)_____________;切点在________之间。限制酶▲看图回答:GAATTCG和A2.若从切点处切开,形成的两个DNA片断是怎样的?▲限制性内切酶的特异性表现在:特定的核苷酸序列-----是“回文序列”(?).特定的切点.被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端.注意:切口处的两条单链一长一短.伸出来的那一条长链叫黏性末端限制酶▲在G和A之间被限制酶切断的是化学键是___________________.▲“黏性末端”和“平末端”当限制酶在它识别序列的中心轴线的两侧将DNA的两条链分别切开时，产生的是黏性末端.而当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，产生的则是平末端。1.要想获得某一个特定性状的基因(即”目的基因”)必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？要切两个切口，产生四个黏性末端.2.如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，产生黏性末端相同吗？会产生相同的黏性末端..思考:▲你是否想过?限制酶是否会切割自己细胞里的DNA呢?为什么?这对于其自身有意义吗?▲DNA连接酶的种类(根据来源分)及其在功能上的异同.----见课文P5.来源功能同异名称E.ColiDNA连接酶T4DNA连接酶大肠杆菌T4噬菌体形成磷酸二酯键只能:互补的黏性末端黏性末端和平末端均可显然,若将上述两者的黏性末端黏合(连接)起来，就似乎可以合成新的DNA分子(重组DNA分子)了用什么工具连接呢?这个工具是怎样将两者连接起来的?2.DNA连接酶——“分子缝合针”DNA连接酶可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，即把梯子两边扶手的断口(注意位置)连接起来，这样一个重组的DNA分子就形成了.▲思考:DNA连接酶的作用是使断口处的相邻的两个脱氧核苷酸之间形成____________键.异:DNA连接酶:是将几个DNA片段连接起来;不需DNA模板.DNA聚合酶:则是将脱氧核苷酸连接(聚合)成DNA;需以DNA的一条链为模板.▲提示:注意比较基因工程中的DNA连接酶和DNA复制中的DNA聚合酶的作用有何异同?同:两种酶都是形成磷酸二酯键.----导入过程需要运输“目的基因”的工具——载体。▲如何将目的基因(如上例中的“抗虫基因”)导入受体细胞(即接受目的基因的生物的细胞,如上例中的棉花细胞)？▲注意:一般地,不能将目的基因直接导入受体细胞.▲载体是什么(生物化学成分)?它从哪里获得?它是如何承载目的基因的?3.基因进入受体细胞的载体---“分子运输车”.常用的运载体主要有两类：1）质粒:一些细菌细胞质里的质粒.2）病毒:噬菌体(即细菌病毒)或某些动、植物病毒.▲什么是质粒?是一种裸露的、结构简单、独立于细菌染色体(即原核的DNA)之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子.质粒是基因工程最常用的载体.绝大多数细菌质粒都是闭合环状DNA分子。有的一个细菌中有一个，有的一个细菌中有多个.▲小结:质粒是小型、环状的DNA分子.最常用的质粒是大肠杆菌的质粒，其中常含有抗药基因，如四环素的标记基因。质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性作用，但复制只能在宿主细胞内完成。▲质粒的一种:大肠杆菌的质粒▲注意:能充当载体的是大肠杆菌的质粒,而不是大肠杆菌.▲载体的作用有哪些？1.作为运输工具，将目的基因(如抗虫基因)转移到受体细胞(如棉花细胞)中去。2.利用载体在受体细胞(如棉花细胞)内，对目的基因(如抗虫基因)进行大量复制。▲作为载体必须具备哪些条件？1）能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。2）载体DNA必须有一个或多个限制酶切点，以便目的基因插入到载体上去。3）具有某些标记基因，便于进行筛选。如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等。4)载体DNA必须是安全的,不会对受体细胞有害,或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去;5)载体DNA分子大小应适合,以便提取和在体外进行操作,太大就不便操作.双基练习：一、基因工程的概念基因工程是指按照人们的愿望,进行严格的设计,通过体外____和____等技术,赋予生物以心得遗传特性,创造出符合人们的需要的新的____和____.又叫做DNA的重组技术.二、DNA重组技术的基本工具1.限制性核酸内切酶-----“分子手术刀”(1)主要来源:从____生物中分离出来的.(2)特点:能够识别DNA特定的核苷酸序列,切开两个____之间的_____.(3)DNA末端:限制酶切割DNA产生的DNA末端有两种形式:______和_______.2.DNA连接酶----“分子缝合针”(1)作用:恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的______.(2)种类:①E.coliDNA连接酶:只能缝合DNA的_____②T4DNA连接酶:既可缝合DNA的_____,又可缝合双链DNA的_______.3.基因进入受体细胞的载体----”分子运输车”(1)载体的种类①质粒:是一种裸露的,结构简单,独立于细菌染色体之外,并能够自我_____能力的双链______DNA分子;②______.③________.(2)载体的特点①能够在细胞内_______;②有一个或多个____切割位点,便于供源DNA的插入.③具有_____基因,供重组DNA的鉴定和选择.▲基因工程的基本操作流程▲基因工程的基本操作程序主要包括四个基本步骤：1）目的基因的获取2）“基因表达载体”的构建3）将目的基因导入受体细胞(即“转化”)4）目的基因的检测与鉴定步骤一：目的基因的获取▲什么叫目的基因?主要是指编码蛋白质的结构基因.▲获取目的基因的途径有哪些?1.从“基因文库”中获取.2.利用“PCR技术”扩增.3.直接人工合成(适合于基因较小且已知其核苷酸顺序)----见课文.共三条.▲从基因文库中获取“目的基因”：什么叫“基因文库”?分为:1.基因组文库:基因文库中包含了一种生物所有的基因,这种基因文库叫做基因组文库.2.部分基因文库:基因文库中包含了一种生物的一部分基因,这种基因文库叫做部分基因文库.如cDNA文库.将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库(genelibrary)类似从图书馆里取书.▲利用PCR技术扩增“目的基因”.1.概念:PCR即“聚合酶链式反应”,是一种在生物体外复制特定DNA片断的技术.2.原理:DNA的半保留复制.3.过程:(见图).4.优点:大量获取目的基因.(指数式扩增,近2n)▲提示与思考:1.图中的“模板DNA”就是已知核苷酸序列的目的基因.2.引物是人工合成的,与模板DNA(即目的基因)互补,作用是使___.3.加热的作用是使_________.4.聚合酶(Tap酶)是指____(选:DNA聚合酶;RNA聚合酶),其特点是_________.5.原料是_________.6.每扩增一次,目的基因的数目增加___.7.“退火”DNA解链▲提示:PCR的基本操作(过程):PCR是一种反复循环的DNA合成反应过程,其基本反应有三个步骤：1.变性:通过加热(高温)使模板DNA完全变性成为单链,同时引物自身和引物之间存在的局部双链也得以消除.2.退火:将温度下降至适宜温度，使引物与模板DNA退火结合；3.延伸:将温度升高,热稳定DNA聚合酶(即耐高温)以dNTP(即脱氧核苷酸)为底物(即原料)催化合成DNA链延伸.以上三步为一个循环，新合成的DNA分子又可以作为下一轮合成的模板，经多次循环后即可达到扩增DNA片段的目的.▲显然,每循环(扩增)一次,就需要添加一次(共两个)引物.▲提示:两个引物、一个模板.▲人工合成目的基因如果基因比较小，核苷酸序列又已知，也可以通过DNA合成仪用化学方法直接合成。1.通过反转录法合成:又分为:目的基因的mRNA(已知)单链DNA双链DNA(即目的基因)反转录合成2.直接合成.根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测目的基因化学合成在获取目的基因后,如何将目的基因导入受体细胞呢?能直接导入吗?必须借助载体!怎样借助载体将目的基因导入受体细胞呢?必须把目的基因“装到”载体上!如何装?步骤二：基因表达载体的构建.▲什么是“基因表达载体”?就是已经装上了(含有)目的基因的载体.1）用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个切口，露出黏性末端。2）用同一种限制酶切取目的基因，使其产生相同的黏性末端。3）将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）▲目的基因与载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程▲基因表达载体的构建步骤.----见课文.▲提示与思考:1.“基因表达载体”就是已插入目的基因的载体.2.看左图回答:基因表达载体由哪些部分组成?___________.3.启动子:是有特殊结构的DNA片断,位于目的基因的首端,是RNA聚合酶的识别和结合的部位.有它才能驱动目的基因转录出MRNA.最终获得蛋白质.(不是复制!)4.终止子:位于目的基因的端尾端.作用是终止转录.5.标记基因:是为了鉴别受体细胞里是否已经含有目的基因,从而将含目的基因的细胞筛选出来.如“抗生素基因”、“荧光标记基因”等.(醒目的,特别的标记)6.复制原点是载体复制(不是转录)时的起点.▲什么叫转化?将目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定(如复制)和表达(即转录、翻译为特定蛋白质及表现特定性状等)的过程.▲受体细胞是指什么?它包括哪些细胞?▲提示:注意,目的