植物细胞工程的基本技术

1996年7月5日,世界上第一只体细胞克隆动物--克隆羊多利诞生于英国。这样的生物技术属于何种生物工程？细胞工程细胞工程是指应用细胞生物学和分子生物学的原理和方法，通过细胞水平或细胞器水平上的操作，按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品的一门综合科学技术。什么叫细胞工程？包括哪两大领域？细胞工程应用的原理和方法研究的水平研究的目的细胞生物学和分子生物学细胞整体水平或细胞器水平按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品概念分类植物细胞工程动物细胞工程理论基础细胞的全能性2.1植物细胞工程§2.1.1植物细胞工程的基本技术植物组织培养所采用技术的理论基础植物细胞工程通常采用的技术手段植物组织培养植物体细胞杂交植物细胞的全能性利用菊花花瓣微型繁殖培养的菊花探究：1、为什么运用植物组织培养技术能把植物离体器官、组织或细胞培养成完整植物体？植物细胞具有全能性。2、什么是细胞的全能性？1、定义：生物体的细胞具有发育成完整个体的潜能的特性。2、原理：生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质，都有发育成为完整个体所必需的全部基因，从理论上讲，生物体的每一个活细胞都应该具有全能性。3、差异：（1）受精卵的全能性最高（2）植物细胞全能性〉动物细胞全能性(3)一、植物细胞的全能性受精卵生殖细胞体细胞＞＞探究：2、生物体内的细胞为什么没有表现出全能性，而是分化成不同的组织器官？1、表现全能性的条件有哪些？离体、一定的营养物质、激素及温度、光照、pH等适宜外界条件。在特定的时间和空间条件下，基因选择性的表达的结果。生物体的每一个细胞都含本物种的全套遗传物质，都有发育成完整个体的全套基因。3、为何已分化的细胞仍具有发育成完整个体的潜能？【提示】(1)植物细胞全能性的条件，除了离体外，还需要种类齐全、比例合适的营养物质和一定植物激素，另外操作中还要注意无菌、控制适宜温度和光等。(2)这不是全能性的反映，植物体上长出新芽，这是细胞分化的结果(基因选择性表达的结果)。4.在生物体内，细胞没有表现出全能性，而是分化为不同的组织、器官，是因为（）A、细胞的基因丧失了全能性B、基因在特定时间和空间条件下选择性表达的结果C、不同的细胞内基因不完全相同D、在个体发育的不同时期，细胞内的基因发生了变化B要把一块组织通过培养得到一株完整植株,应该如何操作呢?请同学们阅读P34实验完成P35讨论题。1958年，美国科学家斯图尔德（F.C.Steward）将胡萝卜韧皮部的一些细胞进行培养获得了完整的胡萝卜新植株。植物组织培养技术切取接种培养室愈伤组织的形成试管苗移栽切取形成层无菌接种诱导愈伤组织的形成试管苗的形成培养室移栽脱分化再分化(4)请根据上面的实验过程，概括出植物组织培养技术的流程简图。(1)在组织培养实验中，为什么要强调所用器械的灭菌和实验人员的无菌操作？防止杂菌污染，因为杂菌生长快，会和培养物争夺营养。杂菌生长过程中会产生有害的物质，导致培养物迅速死亡。(2)在本实验中，切取胡萝卜块根时强调要切取含有形成层部分，原因是这部分容易诱导形成愈伤组织。请思考一下，胡萝卜的其他部分（如茎、叶、花），是否也能培养成小植株，你能用实验的方法进行验证吗？胡萝卜的其他部分（如茎、叶、花）也能培养再生形成小植株，只是诱导愈伤组织比较困难。植物组织培养就是在无菌和人工控制条件下，将离体的植物器官、组织、细胞，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其产生愈伤组织、丛芽，最终形成完整的植株。二、植物组织培养1、概念植物组织培养的培养基无机营养成分：无机盐离子有机营养成分：①含N物质：包括维生素和氨基酸②碳源：2%—5%的蔗糖溶液，调节渗透压③琼脂：起支持作用④激素：生长素，细胞分裂素和赤霉素PH值：5.0－6.0一、植物组织培养离体的植物器官、组织或细胞愈伤组织根、芽植物体外植体脱分化植物激素：细胞分裂素、生长素再分化2、过程植物组织培养条件：含有全部营养成分的培养基、一定的温度、空气、无菌环境、适合的PH、适时光照等。遮光光照细胞分化程度与细胞分裂能力呈负相关。强调几个概念：离体的植物器官、组织或细胞，在培养一段时间以后，通过细胞分裂，形成一种高度液泡化、无定形状态薄壁细胞组成的排列疏松无规则的组织。一、愈伤组织：愈伤组织由高度分化的植物器官、组织或细胞产生愈伤组织的过程，又称去分化。（2）脱分化的实质和结果分别是什么？实质是恢复细胞的全能性过程。结果是形成愈伤组织。脱分化产生的愈伤组织在培养过程中重新分化根或芽等器官的过程。二、（1）植物细胞的脱分化：三、植物细胞的再分化：愈伤组织胚状体根、芽同时发生先根后芽先芽后根人工种子完整植株（三）神奇的人工种子人工种子组成胚状体（或不定芽、顶芽和腋芽）+人工种皮(透气透水易降解+胚乳（营养物质、固氮菌、抗生素等）人工种子：(3)人工种子：①获取方法：以植物组织培养得到的胚状体、不定芽、顶芽和腋芽等为材料，用人工薄膜包装。②解决的问题：a．一些植物繁殖周期长，数年后才能结出种子。b．有些作物优良杂种的后代因发生性状分离而丧失其优良特性。c．常规种子的生产受季节、气候和地域的限制，并且占用大量的土地。1、为什么诱导愈伤组织的过程中应避光培养？在有光时，往往容易形成维管组织，而不易形成愈伤组织。2、决定植物脱分化、再分化的关键因素是什么？植物激素当细胞分裂素和生长素共同使用时，能刺激愈伤组织的形成，而通过调节二者的浓度比，就可以调控植物细胞培养过程中芽和根的形成，称为“激素杠杆”。(见P42)栏目导引新知初探思维启动要点突破讲练互动知能演练轻巧夺冠专题2细胞工程要点二植物的组织培养1.植物组织培养中脱分化与再分化过程的比较名称过程形成体特点条件脱分化离体器官、组织、细胞成为愈伤组织排列疏松、高度液泡化的薄壁细胞团①离体；②提供营养物质(有机物、无机物)；③提供激素(生长素、细胞分裂素等)；④提供其他适宜条件(温度、无菌等)再分化愈伤组织成为幼苗或胚状体结构有根、芽或有生根发芽的能力栏目导引新知初探思维启动要点突破讲练互动知能演练轻巧夺冠专题2细胞工程2.植物激素在植物组织培养中的作用生长素/细胞分裂素的比值作用效果比值高时促进根分化、抑制芽形成比值低时促进芽分化、抑制根形成比值适中促进愈伤组织形成栏目导引新知初探思维启动要点突破讲练互动知能演练轻巧夺冠专题2细胞工程特别提醒(1)植物组织培养成功的关键是避免微生物的污染，所有实验用具都必须严格灭菌，接种过程要进行严格的无菌操作。(2)脱分化培养愈伤组织时要避光(如果此时进行光照，容易分化产生维管等组织，不利于产生大量的愈伤组织)，但再分化过程要有光照，这样有利于诱导形成叶绿素。栏目导引新知初探思维启动要点突破讲练互动知能演练轻巧夺冠专题2细胞工程【易误警示】脱分化和再分化不能在同一培养基上完成，需配制三种生长素、细胞分裂素不同浓度的培养基，中间经过两次转接,才可顺利完成脱分化和再分化过程。一般过程是：在脱分化培养基上形成的愈伤组织，转接到生芽培养基上，待长出丛芽后，再转接到生根培养基上，促其生根。因为不同种生物之间存在着生殖隔离，所以用传统的有性杂交方法是不可能做到这一点的。于是，这些科学家试图用这两种植物的体细胞进行杂交，来实现这一美妙的设想。三、植物体细胞杂交技术这幅番茄—马铃薯图利用传统有性杂交方法能实现吗？为什么？1972年卡尔森等通过两个烟草品种之间原生质体的融合，获得了第一个体细胞杂种。1978年梅尔彻斯(Melchers)等首次获得了番茄和马铃薯的属间体细胞杂种——“Potamato”。目前，已得到栽培烟草与野生烟草、栽培大豆与野生大豆、籼稻与野生稻、籼稻与粳稻、小麦与鹅冠草等细胞杂种及其后代，获得了有价值的新品系或育种上有用的新材料。1、概念：将两个来自不同植物的体细胞融合成一个杂种细胞，且把杂种细胞培育成新的植物体的过程。2、优势：（与有性杂交方法比较）克服了远缘杂交不亲和的障碍，拓展了可用于杂交的亲本组合范围。。植物体细胞杂交二、植物体细胞杂交技术3、成果和未解决的问题成果：克服不同生物远缘杂交的障碍，出现自然界没有的新品种。未解决的问题：未能让杂种植物按照人们的需要表现出亲代的优良。杂种植株融合的原生质体AB再生出细胞壁脱分化愈伤组织再分化1、过程植物细胞的融合植物组织培养植物细胞A原生质体B原生质体A杂种细胞AB去壁去壁人工诱导方法？促进融合的方法？融合完成的标志植物细胞B二、植物体细胞杂交技术细胞融合的基础：细胞膜的流动性去壁去壁纤维素酶果胶酶原生质体植物细胞原生质体融合离心、振动、电刺激、聚乙二醇再生细胞壁杂种细胞去分化愈伤组织杂种植株激素筛选等量激素再分化植物体细胞杂交过程示意图马铃薯细胞番茄细胞杂种细胞1.阻碍植物细胞亲和的结构是什么？怎么去除？融合长壁原生质体纤维素酶和果胶酶2.去壁以后的结构叫什么？3.用什么方法才能让细胞紧密接触并发生融合？4.融合的过程是怎样的？其过程中用到了膜的什么特性？5.融合完成的标志是什么？6.杂种细胞遗传物质有什么特点？7.融合后除杂种细胞外还有哪些融合细胞？物理方法：离心、振动、电击.化学方法：聚乙二醇（PEG）诱导细胞膜融合细胞质融合细胞核融合流动性单核、长出新的细胞壁具有两个物种的遗传物质马—马、番--番所以还要经过筛选才能得到杂种植株1.为什么“番茄—马铃薯”超级杂种植株没有如科学家所想像的那样，地上长番茄、地下结马铃薯？马铃薯—番茄没有像人们预想的那样地上长番茄、地下结马铃薯，主要原因是：生物基因的表达不是孤立的，它们之间是相互调控、相互影响的，所以马铃薯—番茄杂交植株的细胞中虽然具备两个物种的遗传物质，但这些遗传物质的表达受到相互干扰，不能再像马铃薯或番茄植株中的遗传物质一样有序表达，杂交植株不能地上长番茄、地下结马铃薯就是很自然的了。特别提醒(1)杂种细胞产生的标志是新细胞壁的形成，植物体细胞杂交技术完成的标志是得到杂种植株。(2)植物体细胞杂交技术包括植物细胞融合和植物组织培养两个过程。(3)从生殖类型上看，植物体细胞杂交技术没有有性生殖细胞的形成和结合，应属于无性生殖，变异类型应是染色体数目的变异。比较植物组织培养植物体细胞杂交技术所属范畴原理步骤意义联系无性繁殖细胞全能性①脱分化②再分化保持优良性状繁殖速度快、大规模生产提高经济效益杂交技术应用了组织培养克服不同种生物远源杂交的障碍①去除细胞壁、获得有活力的原生质②融合形成杂种细胞③组织培养膜流动性细胞全能性染色体变异、基因重组•(1)不同细胞体现全能性能力的大小不同，具体表现为：受精卵生殖细胞体细胞，离体细胞的全能性表达与分化程度呈负相关，但生殖细胞特殊。•(2)脱分化形成愈伤组织的过程不需要光，再分化过程需要光，因为愈伤组织利用有机营养成分，而试管苗需要进行光合作用以自养。•(3)植物组织培养中不同培养阶段培养基含有的激素比例不同，因为培养的目的不同(生根或生芽)。•(4)植物组织培养中用到的有机碳源一般为蔗糖，用葡萄糖也可以，但后者的成本高。•(5)利用植物组织培养技术生产细胞产物时，有时只需将外植体培养到愈伤组织，从愈伤组织中获取产物。•(6)人工种子发育初期需要的营养物质由人工胚乳提供。•(7)人工种皮中可以加入适量的养分、无机盐、有机碳源以及农药、抗生素、有益菌等，以利于胚状体生长发育成幼苗。1、回忆植物组织培养技术的基本原理和过程？2、思考利用这项技术能做哪些工作？再分化脱分化愈伤组织外植体试管苗植株资料1科学家应用多倍体育种的方法，培育出的三倍体无子西瓜，具有无子、含糖高、口感好等特点。但因其不结种子，每年必须用四倍体和二倍体西瓜杂交培育种子，不仅增加了生产成本，也给无籽西瓜的普及带来困难。资料2病毒引起的植物病害有500多种。受害的植物包括粮食作物、蔬菜、果树和花卉，如水稻、小麦、棉花、马铃薯、油菜、大蒜、苹果、枣、唐菖蒲、兰花等。而且没有有效的防治办法，只能拔除病株，造成很大的经济损失。病毒多集中在种子、老叶等器官中，在幼嫩的器官和未成熟的组织中较少，在分生区几乎不含病毒。资料3兰花