课题2-土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数课题背景尿素[CO（NH2）2]是一种重要的农业氮肥。但是，尿素并不能直接被农作物吸收。只有当土壤中的细菌将尿素分解成氨之后，才能被植物利用。土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶。尿素最初是从人的尿液中发现的。当时，人们普遍相信有机物只能由有生命活力的生物产生，而无法通过化学方法合成。但是，1828年，德国化学家维勒（F.WÖhler）成功地通过无机物的化学反应合成了尿素，揭开了历史上人工合成有机物的新篇章。此后，尿素的生产走向了工业化，尿素也逐步成为农业生产中重要的氮肥。本课题以土壤中能分解尿素的细菌为研究对象，要达到两个主要目的：（1）从土壤中分离出能够分解尿素的细菌；（2）统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌。研究思路（一）筛选菌株DNA多聚酶链式反应（PCR）是一种在体外将少量DNA大量复制的技术（参见专题5课题2）。此项技术的自动化，要求使用耐高温的DNA聚合酶。这种酶要能忍受93℃左右的高温。如果请你来寻找这种耐高温的酶，你会去哪里寻找？科学家是从水生耐热细菌Taq（Thermusaquaticus）中分离到耐高温的TaqDNA聚合酶的。Taq细菌是美国微生物学家布鲁克（T.Brock）于1966年在美国黄石国家公园的一个热泉（图2-6）中发现的。这说明，在寻找目的菌株时，要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。为什么Taq细菌能从热泉中被筛选出来呢？这是因为热泉70～80℃的高温条件淘汰了绝大多数微生物，而使耐热的Taq细菌脱颖而出。实验室中微生物的筛选，也应用了同样的原理，即人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。请你根据这一思路，分析旁栏中本课题将用到的培养基配方，回答下面的问题。1.在该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？2.绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。请你分析该培养基的配方，想一想这种培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，是如何进行选择的？本课题使用的培养基配方KH2PO41.4gNa2HPO42.1gMgSO4·7H2O0.2g葡萄糖10.0g尿素1.0g琼脂15.0g将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1000mL。在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称做选择培养基（selectivemedia）。（二）统计菌落数目想一想，如何根据平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数？在课题1中，我们学习了稀释涂布平板法。这一方法常用来统计样品中活菌的数目。当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。为了保证结果准确，一般选择菌落数在30~300的平板进行计数。两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。1.第一位同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。2.第二位同学在该浓度下涂布了三个平板，统计的菌落数分别为21、212和256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。你认为哪位同学的结果更接近真实值？你认为这两位同学的实验需要改进吗？如果需要，如何改进？每克样品中的菌株数=（C÷V）×M其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积（mL），M代表稀释倍数。值得注意的是，统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。除了上述的活菌计数法外，显微镜直接计数也是测定微生物数量的常用方法。（三）设置对照设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。请你分析下面的实例，想一想如何设置本实验的对照。对照实验是指除了被测试的条件以外，其他条件都相同的实验，其作用是比照实验组，排除任何其他可能原因的干扰，证明确实是所测试的条件引起相应的结果。在做本课题的实验时，A同学从对应106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落。但是，其他同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落。其他同学认为A同学的结果有问题。他们分析可能是A同学的培养基被杂菌污染了，或者培养基中混入了其他含氮物质，因而导致不能分解尿素的细菌也能在该培养基上生长。但是，A同学确信自己的实验操作准确无误，与其他同学的结果之所以不相同，是因为自己所选用的土壤样品不同。但是，A同学在设计实验的时候并没有设置对照，因而此时也拿不出令同学们信服的证据。你能通过设置对照，帮助A同学排除上述两个可能影响实验结果的因素吗？实验设计实验设计包括对实验方案，所需仪器、材料、用具和药品，具体的实施步骤以及时间安排等的综合考虑和安排。一般来说，实验设计做得周密细致，做实验时就能有条不紊，将精力集中在具体的操作上。请你根据实验流程示意图（图2-7）和提供的三个资料，思考有关问题，然后进行实验设计，并写出详细的实验方案。[资料一]土壤取样土壤有“微生物的天然培养基”之称。同其他生物环境相比，土壤中的微生物，数量最大，种类最多。在富含有机质的土壤表层，有更多的微生物生长。土壤中的微生物，大约70%～90%是细菌。细菌适宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，绝大多数分布在距地表约3～8cm的土壤层。因此，土壤取样时，一般要铲去表层土。在城市，常见的是公园里、街道旁、花盆中的土壤；在农村，则容易收集到农田或菜园的土壤。你打算选择什么样的土壤做实验呢？[资料二]样品的稀释样品的稀释程度将直接影响平板上生长的菌落数目。在实际操作中，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数在30～300之间、适于计数的平板。测定土壤中细菌的数量，一般选用104、105和106倍的稀释液进行平板培养；测定放线菌的数量，一般选用103、104和105倍稀释；测定真菌的数量，一般选用102、103和104倍稀释；根据这些数据，请你思考旁栏中的问题。为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量选用的稀释范围相同吗？如果不同，你打算选用多大的稀释范围？当你第一次做这个实验的时候，可以将稀释的范围放宽一点。例如，可以将103～107倍的稀释液分别涂布到平板上培养，以保证能从中选择出菌落数在30～300间的平板进行计数。[资料三]微生物的培养与观察观察是科学研究的基本功。敏锐的观察力来源于实践中一点一滴的积累。不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌一般在30～37℃的温度下培养1～2d；放线菌一般在25～28℃的温度下培养5～7d；而霉菌一般在25～28℃的温度下培养3～4d。在本实验中，我们可以每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，这样可以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。一般来说，在一定的培养条件下（相同的培养基、温度及培养时间），同种微生物表现出稳定的菌落特征。这些特征包括菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等方面（图2-8）。请仔细观察你所分离到的菌落，最好以表格的形式将不同菌落的特征记录下来。操作提示请你根据自己设计的实验方案进行操作。操作中，应特别注意以下一些问题。（一）无菌操作做这个实验前，请你先复习课题1中学习过的无菌操作方法。此外，本课题中的无菌操作还须注意以下几点。1.取土样用的小铁铲和盛土样的信封在使用前都需要灭菌。2.应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。3.在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。研究未知的微生物一定要注意进行规范的无菌操作，以防被致病的微生物感染。实验后，一定要洗手。（二）做好标记本实验使用的平板和试管比较多。为避免混淆，最好在使用前就做好标记。例如，在标记培养皿时（图2-9），应注明培养基种类、培养日期以及平板上培养样品的稀释度等。在进行系列稀释的时候，为避免试管相互混淆，可以将已经进行过稀释操作的试管，按稀释度递增的顺序，依次放置在试管架的另一行。这样，试管的位置就能清楚地表示出稀释进行到哪一步。（三）制定计划对于耗时较长的生物实验，需要事先制定计划，以便提高工作效率，在操作时做到有条不紊。例如，在本实验中，可以在第一天进行实验器材的灭菌以及制备培养基的工作，第二天进行稀释涂布平板的操作，第三、四、五天进行实验结果的观察与记录。结果分析与评价1.结合对照，分析培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出一些菌落。2.是否获得了某一稀释度下，菌落数目在30～300的平板。在这一稀释度下，是否至少有两个平板的菌落数相接近？3.你统计的每克土壤中含有能分解尿素的细菌的菌落数是多少？与其他同学的结果接近吗？如果差异很大，可能是什么原因引起的？课题延伸本课题对能分解尿素的细菌进行了初步的筛选。但是，这只是分离纯化菌种的第一步。对分离的菌种作进一步的鉴定，还需要借助生物化学的方法。在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成了氨。氨会使培养基的碱性增强，pH升高。因此，我们可以通过检测培养基pH的变化来判断该化学反应是否发生。在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红（图2-10）。这样，我们就可以初步鉴定该种细菌能够分解尿素。相关链接活菌计数技术广泛应用于土壤含菌量的测定、食品卫生和水源污染度的检验等方面。如果你感兴趣，可以从下列项目中选做一个。（一）空气中微生物总数的检测（二）水中细菌总数的检测（三）牛奶中细菌的分离与计数（四）土壤中真菌（或放线菌）的分离与计数细菌的数目还可以通过滤膜法来测定(以测定饮用水中大肠杆菌的数目为例)。将已知体积的水过滤后，将滤膜放在伊红美蓝培养基(参见附录3)上培养。在该培养基上，大肠杆菌的菌落呈现黑色。可以根据培养基上黑色菌落的数目，计算出水样中大肠杆菌的数量。练习1.请你描述一个细菌在琼脂平板上形成一个肉眼可见的菌落的过程，并描述活菌计数的原理与方法。2.反刍动物，如牛和山羊，具有特殊的器官——瘤胃。在瘤胃中生活着多种微生物，其中许多微生物能以尿素作唯一氮源。请你设计一个实验，从瘤胃中分离出能够分解尿素的微生物。