分子生物学-转录

第十六章RNA的生物合成RNABiosynthesis掌握：DNA复制和转录的区别掌握：转录模板的特点和所需的酶理解：原核和真核生物转录的过程及二者间的差异熟悉：真核生物mRNA的加工过程（掌握断裂基因、内含子、外显子的概念）了解：tRNA和rRNA的加工学习目标在生物界，RNA合成有两种方式：一是DNA指导的RNA合成，也叫转录，此为生物体内的主要合成方式，也是本章介绍的主要内容。另一种是RNA指导的RNA合成(RNA-dependentRNAsynthesis)，也叫RNA复制(RNAreplication),由RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependentRNApolymerase)催化，常见于病毒，是逆转录病毒以外的RNA病毒在宿主细胞以病毒的单链RNA为模板合成RNA的方式。转录(transcription)生物体以DNA为模板合成RNA的过程(原料、原则、酶、方向）。转录RNADNA目录复制和转录的相同点酶促的核苷酸聚合；DNA为模板；依赖DNA的聚合酶；生成3’，5’磷酸二酯键；5’→3’方向聚合；遵从碱基配对规律。复制和转录的区别A-U，T-A，G-CA-T，G-C配对mRNA，tRNA，rRNA子代双链DNA（半保留复制）产物RNA聚合酶（RNA-pol）DNA聚合酶酶NTPdNTP原料模板链转录（不对称转录）两股链均复制模板转录复制A-U，T-A，G-CA-T，G-C配对mRNA，tRNA，rRNA子代双链DNA（半保留复制）产物RNA聚合酶（RNA-pol）DNA聚合酶酶NTPdNTP原料模板链转录（不对称转录）两股链均复制模板转录复制引物需要不需要参与转录的物质原料:NTP(ATP,UTP,GTP,CTP)模板:DNA酶:RNA聚合酶(RNApolymerase,RNA-pol)其他蛋白质因子模板和酶TemplatesandEnzymes第一节5335模板链编码链编码链模板链转录方向转录方向一、转录模板不对称转录不对称转录(asymmetrictranscription)•在DNA分子双链上某一区段，一股链用作模板指引转录，另一股链不转录；•模板链并非永远在同一条单链上。•DNA分子上能转录出RNA的区段，称为结构基因(structuralgene)。•DNA双链中按碱基配对规律能指引转录生成RNA的一股单链，称为模板链(templatestrand)，也称作无意义链或Watson链。相对的另一股单链是编码链(codingstrand)，也称为有意义链或Crick链。5′···GCAGTACATGTC···3′3′···cgtgatgtacag···5′5′···GCAGUACAUGUC···3′N······Ala·Val·His·Val······C编码链模板链mRNA蛋白质转录翻译目录RogerKornbergWonNobelPrizeforchemistry2006.二、RNA聚合酶（一）RNA聚合酶催化RNA链合成的机制RNA合成的化学机制与DNA依赖的DNA聚合酶催化DNA合成相似。(NMP)n+NTP→(NMP)n+1+PPiRNA延长的RNADNA聚合酶在启动DNA链延长时需要引物存在，而RNA聚合酶不需要引物就能直接启动RNA链的延长。（二）原核生物的RNA聚合酶（1种）36512决定哪些基因被转录150618催化功能155613结合DNA模板70263辨认起始点亚基分子量功能核心酶(coreenzyme)全酶(holoenzyme)参与转录延伸参与转录起始利福平和β亚基结合抑制RNA聚合酶目录种类ⅠⅡⅢ转录产物rRNA的前体45SrRNAmRNA前体hnRNA,lncRNA,piRNA,miRNAtRNA,5SrRNAsnRNA对鹅膏蕈碱的反应耐受敏感高浓度下敏感（中度敏感）细胞内定位核仁核内核内（三）真核生物的RNA聚合酶（3种）•均由多个亚基构成，抑制剂——鹅膏蕈碱（毒蘑菇“死亡之伞”）目录Amanitaphalloides（deathcap）α-amanitin真核生物RNA聚合酶的结构比原核生物复杂，所有真核生物的RNA聚合酶都有两个不同的大亚基和十几个小亚基.RNA聚合酶Ⅱ由12个亚基组成，其最大的亚基称为RBP1。RNA聚合酶Ⅱ最大亚基的羧基末端有一段共有序列(consensussequence)为Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser的重复序列片段，称为羧基末端结构域(carboxyl-terminaldomain,CTD)。CTD对于维持细胞的活性是必需的。原核生物的转录过程TheProcessofTranscriptioninProkaryote第二节（一）转录起始一、原核生物的转录过程起始延长终止2.DNA双链局部解开，形成开放转录复合体(opentranscriptioncomplex)；1.RNA聚合酶全酶(2)与模板结合，形成闭合转录复合体(closedtranscriptioncomplex)；3.在RNA聚合酶作用下发生第一次聚合反应，形成转录起始复合物：RNApol(2)-DNA-pppGpN-OH3转录起始复合物:5-pppG-OH+NTP5-pppGpN-OH3+ppi转录起始过程：4.亚基脱落1、模板上酶的辨认、结合5335结构基因RNA-pol调节序列转录是不连续、分区段进行的。每一转录区段可视为一个转录单位，称为操纵子(operon)。操纵子包括若干个结构基因及其上游(upstream)的调控序列。调控序列中的启动子是RNA聚合酶最先结合模板DNA的部位，也是控制转录的关键部位。原核生物以RNA聚合酶全酶结合到DNA的启动子上而起动转录，其中由σ亚基辨认启动子，其他亚基相互配合。对启动子的研究，常采用一种巧妙的方法即RNA聚合酶保护法。RNA聚合酶保护法（Footprinting）开始转录TTGACAAACTGT-35区(Pribnowbox)TATAATATATTA-10区1-30-5010-10-40-205335原核生物启动子保守序列RNA-pol辨认位点(recognitionsite)55RNA聚合酶保护区结构基因33RNA聚合酶全酶在转录起始区的结合:E.coli开放转录复合体的形成2.DNA双链局部解开，形成开放转录复合体(opentranscriptioncomplex)；1.RNA聚合酶全酶(2)与模板结合，形成闭合转录复合体(closedtranscriptioncomplex)；3.在RNA聚合酶作用下发生第一次聚合反应，形成转录起始复合物：RNApol(2)-DNA-pppGpN-OH3转录起始复合物:5-pppG-OH+NTP5-pppGpN-OH3+ppi转录起始过程：4.亚基脱落cycle（二）转录延长1.亚基脱落，RNA–pol聚合酶核心酶变构，与模板结合松弛，沿着DNA模板前移；2.在核心酶作用下，NTP不断聚合，RNA链不断延长。(NMP)n+NTP(NMP)n+1+PPiUnwindinggeneratessupercoilsintheDNAthatcanberelievedbyDNAtopoisomerases.ActinomycinDwasthefirstantibiotictofindtherapeuticapplicationintumorchemotherapy.ItbindstotheDNAtemplateandinterfereswiththemovementofRNApolymerasealongtheDNA.目录转录空泡(transcriptionbubble)：RNA-pol（核心酶）····DNA····RNA53DNA原核生物转录过程中的羽毛状现象核糖体RNARNA聚合酶在同一DNA模板上，有多个转录同时在进行；转录尚未完成，翻译已在进行。这种形状说明：原核生物的边转录边翻译电镜照片识别转录起始部位。与模板链结合，并使DNA双链打开。催化NTP的聚合。缺乏外切酶活性,无校对功能。不同的识别不同的转录起始位点。RNA聚合酶作用特点依赖Rho(ρ)因子的转录终止非依赖Rho因子的转录终止（三）转录终止指RNA聚合酶在DNA模板上停顿下来不再前进，转录产物RNA链从转录复合物上脱落下来。分类1.非依赖Rho因子的转录终止DNA模板上靠近终止处，有些特殊的碱基序列，转录出RNA后，RNA产物形成特殊的结构来终止转录，这种方式较普遍。反向重复序列与发夹Invertedrepeatsandhairpins5’NNGAATGCCNNNGGCATTCNN3’3’NNCTTACGGNNNCCGTAAGNN5’5’NNGAAUGCCNNNGGCAUUCNN3’茎环/发夹结构茎环结构使转录终止的机理•使RNA聚合酶变构，转录停顿；•使转录复合物趋于解离，RNA产物释放。5´pppG5335RNA-polATP2.依赖Rho因子的转录终止相对少见，主要见于噬菌体。Rhofactor:ATPaseactivityhelicaseactivity易与polyC结合真核生物的转录过程TheProcessofTranscriptioninEukaryote第三节（一）转录起始前的上游区段不同物种、不同细胞或不同的基因，转录起始点上游可以有不同的DNA序列，但这些序列都可统称为顺式作用元件(cis-actingelement)。一、真核生物的转录起始过程真核生物的转录起始上游区段比原核生物多样化，转录起始时，RNA-pol不直接结合模板，其起始过程比原核生物复杂。顺式作用元件包括启动子、启动子上游元件(upstreampromoterelements)或promoter-proximalelements)等近端调控元件和增强子(enhancer)、沉默子等远隔序列。一个典型的真核生物基因上游序列:5’3’调控序列TATA盒InrYYANYYTA-30+1TATAAA起始点上游多数有共同的TATA序列，称为Hognest盒或TATA盒(TATAbox)。TATA盒和Inr一起通常被称为核心启动子。目录TATA盒的作用在于决定转录的起点，序列的改变会使转录位点偏移；缺失TATA盒，转录将在许多位点上开始。TATA盒决定转录的效率：如鸡蛋清蛋白基因启动子的TATA变为TAGA后，转录效率大大下降转录起始点TATA盒CAAT盒GC盒增强子顺式作用元件(cis-actingelement)AATAAA切离加尾转录终止点修饰点外显子翻译起始点内含子OCT-1OCT-1：ATTTGCAT八聚体（二）转录因子能直接、间接辨认和结合转录上游区段DNA的蛋白质，现已发现数百种，统称为反式作用因子(trans-actingfactors)。反式作用因子中，直接或间接结合RNA聚合酶的，则称为转录因子(transcriptionalfactors,TF)，或基本转录因子/通用转录因子。参与RNA-polⅡ转录的TFⅡ蛋白激酶活性，使CTD磷酸化TFⅡHATPase57（）34（）TFⅡE解螺旋酶30，74TFⅡF促进RNA-polⅡ结合及作为其他因子结合的桥梁33TFⅡB稳定TFⅡD-DNA复合物12，19，35TFⅡA辅助TBP-DNA结合TAF**结合TATA盒TBP*38TFⅡD功能亚基组成，分子量(kD)转录因子蛋白激酶活性，使CTD磷酸化TFⅡHATPase57（）34（）TFⅡE解螺旋酶30，74TFⅡF促进RNA-polⅡ结合及作为其他因子结合的桥梁33TFⅡB稳定TFⅡD-DNA复合物12，19，35TFⅡA辅助TBP-DNA结合TAF**结合TATA盒TBP*38TFⅡD功能亚基组成，分子量(kD)转录因子稳定TFⅡD-DNA复合物，结合