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分子生物学与细胞生物学实验基本技术2005-02实验一组织块培养法一、目的学习原代培养方法，从供体取得组织细胞后在体外进行的首次培养。二、概述组织块培养法是常用的、简便易行和成功率较高的原代培养方法。可以采用剪切法，即将组织块剪切成小块后，接种于培养瓶，组织小块贴壁24h或更长时间后，细胞就从组织四周游出。但由于在反复剪切和接种过程中对组织块的损伤，并不是每个小块都能长出细胞。用于组织块培养的培养瓶可根据不同细胞生长的需要作适当处理，如预先涂以胶原薄层，以利于上皮样细胞等的生长。（本节以新生牛主动脉平滑肌培养为例）三、材料（一）仪器1.净化工作台2.恒温水浴箱3.冰箱（4℃、-20℃）4.倒置相差显微镜5.培养箱（二）玻璃器皿1.培养皿（Φ100mm）2.吸管（弯头）3.烧杯（500ml、200ml、10ml）4.广口试剂瓶（500ml）5.玻璃瓶（250ml、100ml）6.培养瓶7.废液缸（三）塑料器皿1.吸头2.枪头3.胶塞4.EP管（四）其他物品1.微量加样枪2.眼科组织剪（直尖、弯）3.眼科组织镊（直、弯）4.12.5cm组织镊（无钩、1×2钩）5.25cm敷料镊（无钩）6.止血钳（18cm直纹式、12.5cm直纹式、弯纹式）7.解剖剪（五）试剂1.D-Hanks液2.小牛血清3.RPMI16404.双抗（青霉素、链霉素）5.1NHCl6.7.4%NaHCO3四、操作步骤1.取材：打开胸腔，无菌操作下取出主动脉胸段，浸到预先配制好的含双抗（500u/ml青、链酶素）的D-Hanks液中漂洗。2.组织的冲洗、修剪：取出主动脉，用锋利的剪刀修剪除去周围组织，再用D-Hanks冲洗主动脉3次，除去血块及杂组织等。3.平滑肌组织分离：纵向剖开主动脉，撕下主动脉内层，取主动脉中层的平滑肌组织，无血清RPMI1640漂洗3次。4.剪切：将平滑肌组织用锋利的眼科剪反复剪切至剪成1mm3小块，在剪切过程中，可以适当向组织中滴加1～2滴培养液，以保持湿润。5.贴块：将剪切好的组织小块，用眼科镊送入培养瓶内，用弯头吸管将组织块均匀摆置，每小块间距0.5cm左右，组织块放置好后，轻轻将培养瓶翻转，让瓶底朝上，向瓶内注入适量含10%牛血清培养液，盖好瓶盖。6.培养：将培养瓶瓶底朝上，37℃培养箱放置2～4h，待组织小块贴附后，将培养瓶慢慢翻转平放，静置培养。7.换液：原代培养3～5d，需换液一次，去除漂浮的组织块和残留的血细胞。组织块培养法也可不用翻转法，即在摆放组织块后，向培养瓶内仅加入少量培养液，以能保持组织块湿润即可，盖好瓶盖，放置37℃培养箱24h再补加培养液。注意事项1.取材的组织最好尽快培养。因故不能即时培养，可将组织浸泡于培养液内，放置于冰浴或4℃冰箱中，如果组织块很大，应切成1cm3以下的小块再低温保存，但时间不能超过24h。2.从消化道、周围有坏死组织等污染因素存在的区域取材，可用含500～1000u/ml的青、链霉素BSS液漂洗5～10min，或用10%达克宁注射液冲洗浸泡10min再作培养。3.组织块不易贴壁，可预先在瓶壁涂薄层血清、胎汁或鼠尾胶等。4.原代培养的1～2d内要特别注意观察是否有细菌、霉菌的污染，一旦发现，要及时清除。审实验二消化培养法一、目的学习原代培养方法，从供体取得组织细胞后在体外进行的首次培养二、概述此法采用消化分离法（即结合生化和化学手段把已剪切成小体积的组织进一步分散的方法），将妨碍细胞生长的细胞间质包括基质、纤维等去除，使细胞分散，形成悬液，可直接进行培养。分散后细胞易于从外界吸收养分和排出代谢产物，容易生长，存活率高，可以很快得到大量活细胞，细胞在短时间内生长成片。由于各种消化试剂的作用机制各不相同，要根据组织类型和培养的具体要求选择消化方法和试剂。本方法适用于培养大量组织，原代细胞产量高，但步骤繁琐，易污染。（本节以乳鼠心肌细胞培养为例）三、材料：（一）仪器1.净化工作台2.离心机3.恒温水浴箱4.摇床（37℃）5.冰箱（4℃、-20℃）6.倒置相差显微镜7.培养箱（二）玻璃器皿1.培养皿（Φ100mm）2.吸管（弯头、直头）3.烧杯（200ml、10ml）4.玻璃瓶（250ml、100ml）5.玻璃漏斗6.培养瓶7.废液缸（三）塑料器皿1.吸头2.枪头3.胶塞4.15ml离心管5.EP管（四）其他物品1.微量加样枪2.眼科组织剪（直尖、弯）3.眼科组织镊（直、弯）4.12.5cm组织镊（无钩）5.红血球计数板6.泡沫板7.大头针8.尼龙网膜（140目）（五）试剂1.D-Hanks液2.小牛血清3.DMEM4.双抗（青霉素、链霉素）5.胰蛋白酶（0.08%）6.1NHCl7.7.4%NaHCO3四、操作步骤1.取材：取新生1～3天的乳鼠，雌雄兼用，75%酒精消毒3次，用大头针将乳鼠固定在泡沫板上，无菌操作下打开胸腔，取出心脏，放入装有D—Hanks液的培养皿中。2.组织修剪、漂洗：修剪去除血管等杂组织，D—Hanks液中漂洗数次，以除去血块等。3.剪切：将心室肌用锋利的眼科剪反复剪切组织至剪成1～2mm3小块，在剪切过程中，可以适当向组织中滴加1～2滴培养液，以保持湿润。4.消化：将组织小块转移至100ml的玻璃瓶中，再加入30～50倍组织量并预温37℃的0.08%胰酶消化液，37℃摇床消化6min左右。5.细胞分离：消化完毕，用吸管轻轻吸吹几下，使组织小块散开，静置2min后，吸取上面的混悬液（弃去第1次的混悬液），经140目尼龙网膜过滤至盛有终止液试管中，1000rpm，离心10分钟，弃去上清，加适量的培养液悬混。在装有组织小块的玻璃瓶中再加入30～50倍组织量并预温37℃的0.08%胰酶消化液，重复第4、5步骤，直至大部分组织小块消失。6.细胞计数：将上述获得的细胞悬液，吸出少许，适当稀释，加台盼蓝溶液染色，用红血球计数板计数活细胞和死细胞，计算细胞密度和存活率。7.细胞接种：将细胞接种至30ml的培养瓶中，每瓶6×105，用含15%小牛血清的DMEM培养液培养。8.培养：5%CO2、37℃培养箱培养12h，显微镜下可见细胞贴壁，呈多角形，培养24h，镜下见细胞已连结在一起，部分细胞开始搏动。9.换液：培养3～5d，细胞换液。五、注意事项1.取材的组织最好尽快培养。因故不能即时培养，可将组织浸泡于培养液内，放置于冰浴或4℃冰箱中，如果组织块很大，应切成1cm3以下的小块再低温保存，但时间不能超过24h。2.从消化道、周围有坏死组织等污染因素存在的区域取材，可用含500~1000u/ml的青、链霉素BSS液漂洗5~10min，或用10%达克宁注射液冲洗浸泡10min再作培养。3.原代培养的1~2d内要特别注意观察是否有细菌、霉菌的污染，一旦发现，要及时清除。审实验三细胞传代一、目的学习细胞传代方法，扩增细胞，建立细胞系。二、概述培养细胞传代根据不同细胞采取不同的方法。贴壁生长的细胞用消化法传代；部分贴壁生长的细胞用直接吹打可传代；悬浮生长的细胞可以采用直接吹打或离心分离后传代，或用自然沉降法吸除上清后，再吹打传代。三、材料（一）仪器1.净化工作台2.离心机3.恒温水浴箱4.冰箱（4℃、-20℃）5.倒置相差显微镜6.培养箱（二）玻璃器皿1.吸管（弯头、直头）2.玻璃瓶（250ml、100ml）3.培养瓶4.废液缸（三）塑料器皿1.吸头2.枪头3.胶塞4.15ml离心管5.EP管（四）其他物品1.微量加样枪2.红血球计数板（五）试剂1.D-Hanks液2.小牛血清3.RPMI16404.双抗（青霉素、链霉素）5.胰蛋白酶（0.08%）或EDTA或两者混合液6.1NHCl7.4%NaHCO3四、操作步骤（一）贴壁细胞的消化法传代：1.吸除或倒掉瓶内旧培养液。2.D-Hanks液洗2～3次。3.向瓶内加入适量消化液（胰蛋白酶或与EDTA混合液）轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有细胞表面，然后吸掉或倒掉消化液后再加适量新的消化液，轻轻摇动再倒掉大部分消化液，仅留少许进行消化。也可不采用上述步骤直接加消化液进行消化。4.消化最好在37℃或室温25℃以上环境下进行。消化2～5min后把培养瓶放置显微镜下进行观察，发现胞质回缩，细胞间隙增大后，应立即终止消化。5.吸除或倒掉消化液，如用EDTA消化，需加Hanks液数毫升，轻轻转动培养瓶把残留消化液冲掉，然后再加培养液。如仅用胰蛋白酶可直接加少许含血清的培养液，终止消化。6.用弯头吸管，吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，吹打过程要顺序进行，从培养瓶底部一边开始到另一边结束，以确保所有底部都被吹到，使细胞脱离瓶壁后形成细胞悬液。吹打时动作要轻柔不要用力过猛。7.计数，分别接种在新的培养瓶内。（二）悬浮细胞的传代悬浮细胞传代可离心收集细胞后传代，或直接传代。离心传代法：1.将细胞连同培养液一并转移到15ml离心管内；2.离心800～1000rpm，5min；3.弃去上清，加新的培养液到离心管内，用吸管吹打形成细胞悬液；4.计数，分别接种在新的培养瓶内。直接传代即让悬浮细胞慢慢沉淀在瓶底后，将上清液吸掉1/2～2/3，然后用吸管吹打形成细胞悬液后再传代。(三)、部分贴壁细胞的传代部分贴壁不牢的细胞，如Hela细胞等，不经消化处理直接吹打可使细胞从壁上脱落下来，而进行传代。对绝大部分贴壁生长的细胞，因直接吹打对细胞损伤较大，细胞常有较大数量的丢失，因而需消化后，才能吹打传代。五、注意事项1.胰蛋白酶要预温，温度37℃左右为宜℃。2.离心转速要合适，转速过低，不能有效分离细胞，离心速度过大，时间过长，会挤压细胞造成损伤甚至死亡。3.要定时观察细胞，发现污染，应及时处理。审实验四细胞冻存和复苏一、目的学习细胞冻存和复苏的方法，掌握长期保存体外培养细胞的技术。二、概述细胞培养的传代及日常维持过程中，在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费，而且细胞一旦离开活体开始原代培养，它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。因此及时进行细胞冻存十分必要。细胞冷冻储存在-70℃冰箱中可以保存一年之久；细胞储存在液氮中，温度达-196℃，理论上储存时间是无限的。细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。三、材料（一）仪器1.净化工作台2.离心机3.恒温水浴箱4.冰箱（4℃、-20℃、-70℃）5.倒置相差显微镜6.培养箱7.液氮冰箱（二）玻璃器皿1.吸管（弯头、直头）2.培养瓶3.玻璃瓶（250ml、100ml）4.废液缸（三）塑料器皿1.吸头2.枪头3.胶塞4.移液管（10ml）5.15ml离心管6.冻存管（1～2ml）（四）其他物品1.微量加样枪2.红血球计数板3.记号笔4.医用橡皮膏5.移液枪（五）试剂1.D-Hanks液2.小牛血清3.培养液4.双抗（青霉素、链霉素）5.胰蛋白酶（0.08%）6.1NHCl7.7.4%NaHCO38.DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油四、操作步骤（一）细胞冻存1.配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液；2.取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中、；3.离心1000rpm，5min；4.去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml；5.将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5ml；6.在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；7.冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/min；到-