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6个简答和2个论述题CAS-ibp-2004名词解释：肽平面；肽键中的C—N键具有部分双键的特征，不能自由旋转，这些现象是因共振而产生的。其结果使肽键处在一个刚性的平面上，此平面被称为肽键平面(酰胺平面)。磷酸戊糖途径；一个葡萄糖-6-磷酸经代谢产生NADPH和核糖-5-磷酸的途径。其过程可以分为两个阶段：①六碳糖（6-磷酸-葡萄糖）脱羧形成五碳糖（5-磷酸-核酮糖），并伴有NADPH+H+和CO2的生成；②5-磷酸-核酮糖通过异构化，转酮基，转醛基与糖酵解途径联系起来。荧光共振能量转移（FRET）；当一个荧光分子（又称为供体分子）的荧光光谱与另一个荧光分子（又称为受体分子）的激发光谱相重叠时，供体荧光分子的激发能诱发受体分子发出荧光，同时供体荧光分子自身的荧光强度衰减。简答：1“限制性内切酶是原核生物抵抗外界，免疫防御的一道防线”这句话如何理解。定义：限制性核酸内切酶是可以识别特定的核苷酸序列，并在每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶，简称限制酶。在20世纪60年代，人们就注意到DNA在感染宿主后会被降解的现象，从而提出限制性切酶和限制酶的概念。1968年，首次从E.coliK中分离到限制酶，它有特定的识别位点但没有特定的切割位点，其中切割位点离识别位点达1000bp以上。1970年，美国约翰·霍布金斯大学的H.Smith于偶然中发现，流感嗜血杆菌（Haemophilusinfluenzae）能迅速降解外源的噬菌体DNA，其细胞提取液可降解E.coliDNA，但不能降解自身DNA，从而找到HindⅡ限制性内切酶。限制性核酸内切酶分布极广，几乎在所有细菌的属、种中都发现至少一种限制性内切酶，多者在一属中就有几十种，例如在嗜血杆菌属中（Haemophilus）现已发现的就有22种。限制作用实际就是限制酶降解外源DNA，维护宿主遗传稳定的保护机制。甲基化是常见的修饰作用，可使腺嘌呤A和胞嘧啶C甲基化而受到保护。通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目的。所以，能产生防御病毒侵染的限制酶的细菌，其自身的基因组中可能有该酶识别的序列，只是该识别序列或酶切位点被甲基化了。2限制性内切酶2的分类及特点？限制性核酸内切酶（restrictionendonucleases），简称限制酶，是一类能识别和切割双链DNA分子中的某些特定核苷酸序列的核酸水解酶，主要从细菌中分离得到。根据结构和功能特性，把限制酶分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型。Ⅰ型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而Ⅱ型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的水解。III型限制性内切酶同时具有修饰及认知切割的作用。3原核表达载体，画图表示，指出各部分的功能。原核表达载体指：能携带插入的外源核酸序列进入原核细胞中进行表达的载体。原核表达载体调控原件：启动子：是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并起始RNA合成的序列，它是基因表达不可缺少的重要调控序列。在转录起始点上游5～10bp处，有一段由6～8个碱基组成，富含A和T的区域，称为Pribnow盒，又名TATA盒或－10区。来源不同的启动子，Pribnow盒的碱基顺序稍有变化。在距转录起始位点上游35bp处，有一段由10bp组成的区域，称为-35区。SD序列：它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10bp处的由3～9bp组成的序列。这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16SrRNA3¢末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。终止子：一个操纵子的3'末端往往有特定的核苷酸序列，且具有终止转录功能，这一序列称之为转录终止子，简称终止子(terminator)。4酵母表达载体，画图表示，指出各部分的功能。载体基本信息载体名称:pYES2-CT,pYES2/CT质粒类型:酿酒酵母表达载体表达水平:高拷贝诱导方法:半乳糖启动子:GAL1克隆方法:多克隆位点，限制性内切酶5测序引物及序列:GAL1-F:AATATACCTCTATACTTTAACGTC3测序引物及序列:CYC1-R:GCGTGAATGTAAGCGTGAC载体标签:C-His,C-V5载体抗性:氨苄青霉素筛选标记:URA3报告基因克隆菌株:TOP10,E.coli表达菌株:INVSc1,Saccharomycescerevisiae备注:酿酒酵母表达载体pYES2/CT含有URA3报告基因；GAL1启动子驱动目的基因高水平表达；半乳糖诱导目基因表达，葡萄糖阻遏目的基因表达，二者起到分子开关作用。组成型/诱导型:诱导型5以lac为例说明操纵子。操纵子（operon）：很多功能上相关的基因前后相连成串，由一个共同的控制区进行转录的控制，包括结构基因以及调节基因的整个DNA序列。当在培养基中只有乳糖时由于乳糖的代谢产物异乳糖是lac操纵子的诱导物，它可以结合在阻遏蛋白的变构位点上，使构象发生改变，破坏了阻遏蛋白与操纵基因的亲和力，不能与操纵基因结合，于是RNA聚合酶结合于启动子，并顺利地通过操纵基因，进行结构基因的转录，产生大量分解乳糖的酶，这就是当大肠杆菌的培养基中只有乳糖时利用乳糖的原因。6判断PCR产物1.琼脂糖凝胶电泳同时点分子量marker,根据marker条带判断产物分子量大小,从而大致判断是不是你要的2.酶切已知你产物的序列,看上面有什么酶切位点,用一个酶或者两个酶切断,看与理论预测的条带数目和大小是否一致.一般检测有以上两步就行了,如果需要知道确切的需要进行33.测序连接到pMD-18t载体上,转到大肠杆菌中.拿到公司去测序,测序结果通过genebank比对看与哪个基因一致,这种方法最准确4.表达pcr产物连到真核或者原核表达载体上,适宜条件表达出来以后的蛋白做质谱分析,看与理论产物表达的蛋白是否有一致的片段。7真核表达调控真核基因表达调控的特点：真核基因表达调控的环节更多；基因表达是基因经过转录、翻译、产生有生物活性的蛋白质的整个过程。真核基因的转录与染色质的结构变化相关；真核基因组DNA绝大部分都在细胞核内与组蛋白等结合成染色质，染色质的结构、染色质中NA和组蛋白的结构状态都影响转录。真核基因表达以正性调控为主；真核RNA聚合酶对启动子的亲和力很低，基本上不依靠自身来起始转录，需要依赖多种激活蛋白的协同作用。真核基因调控中虽然也发现有负性调控元件，但其存在并不普遍。真核基因转录水平的调控：顺式作用元件：一、启动子，真核同启动子间不像原核那样有明显共同一致的序列，而且单靠RNA聚合酶难以结合DNA而起动转录，而是需要多种蛋白质因子的相互协调作用，不同蛋白质因子又能与不同DNA序列相互作用，不同基因转录起始及其调控所需的蛋白因子也不完全相同，因而不同启动子序列也很不相同，要比原核更复杂、序列也更长。；二、增强子，增强子提高同一条DNA链上基因转录效率，可以远距离作用，通常可距离1－4kb、个别情况下离开所调控的基因30kb仍能发挥作用，而且在基因的上游或下游都能起作用。三、沉寂子，最早在酵母中发现，以后在T淋巴细胞的T抗原受体基因的转录和重排中证实这种负调控顺式元件的存在。反式作用因子：以反式作用影响转录的因子可统称为转录因子(transcriptionfactors,TF)，在真核细胞中RNA聚合酶通常不能单独发挥转录作用，而需要与其他转录因子共同协作。转录因子从功能上分析其结构可包含有不同区域，①DNA结合域(DNAbindingdomain)，多由60－100个氨基酸残基组织的几个亚区组成；②转录激活域(activatingdomain)，常由30－100氨基酸残基组成，这结构域有富含酸性氨基酸、富含谷氨酰胺、富含脯氨酸等不同种类，以酸性结构域最多见；③连接区，即连接上两个结构域的部分。常见DNA结合域：①螺旋-转角-螺旋及螺旋-环-螺旋，②锌指(zincfinger)，③碱性－亮氨酸拉链等。8如何设计引物将两个基因片段融合在一起？9化学合成的寡核酸片断在连接前为何5'端要磷酸化，磷酸化的方法？DNA连接酶（DNALigase）也称DNA黏合酶，在分子生物学中扮演一个既特殊又关键的角色，那就是连接DNA链3‘-OH末端和，另一DNA链的5’-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连成完整的链。5'端磷酸化：T4多聚核苷酸激酶(T4PolynucleotideKinase)该酶能够催化磷酸在ATP的γ-位和寡核苷酸链（双链或单链DNA或RNA）的5'-羟基末端的磷酸化，以便进行连接反应。它的缓冲液为:70mMTris-HCl(pH7.6),10mMMgCl2,5mMDTT,在液中加入终浓度为1mM的ATP，37°C温育1小时。该酶在新鲜缓冲液中表现最适酶活力（在旧缓冲液中，由于DTT氧化而造成的实际DTT含量减少会降低酶活力）。要提高5'平滑末端或5'凹陷末端的磷酸化效率，可在加T4多聚核苷酸激酶前，先将DNA溶液于70°C加热5分钟，然后冰上冷却，或者加入5%(W/V)的PEG-8,000。由于T4多聚核苷酸激酶可被铵离子所抑制，所以磷酸化步骤前，DNA不要在含铵离子的溶液中沉淀。FPLCFPLC全称为快速蛋白液相色谱（Fastproteinliquidchromatography），FPLC是专门用来分离蛋白质、多肽及多核苷酸的系统，是HPLC近年来的一项重要革新，它不但保持了HPLC的快速、高分辨率等特性，而且还具有柱容量大、回收效率高及不易使生物大分子失活等特性。原理与HPLC(高效液相色谱)相同：都是由经典的液体柱层析引入气相色谱理论，并且对相体进行了改革，配用高压输液泵，采用高灵敏检测器、梯度洗脱装置、自动收集装置和微机等发展起来的现代液相色谱。特点：二者均具有快速、分辨率高、检测灵敏度高、分离效能高等特点，而且FPLC还具有柱容量大、回收效率高及不易使生物大分子失活等特性。应用范围：HPLC可分析低分子量沸点样品；高沸点、中分子、高分子有机化合物（包括极性、非极性）；离子型无机化合物；热不稳定，具有生物活性的生物分子。FPLC是专门用来分离蛋白质、多肽及多核苷酸的系统，应用于蛋白、有机化合物的分离纯化，比HPLC操作过程简单，费时少，重复性好，但购买商品化...论述题：1质谱的原理及在分子生物学的应用？原理：使试样中各组分电离生成不同荷质比的离子，经加速电场的作用，形成离子束，进入质量分析器，利用电场和磁场使发生相反的速度色散——离子束中速度较慢的离子通过电场后偏转大，速度快的偏转小；在磁场中离子发生角速度矢量相反的偏转，即速度慢的离子依然偏转大，速度快的偏转小；当两个场的偏转作用彼此补偿时，它们的轨道便相交于一点。与此同时，在磁场中还能发生质量的分离，这样就使具有同一质荷比而速度不同的离子聚焦在同一点上，不同质荷比的离子聚焦在不同的点上，将它们分别聚焦而得到质谱图，从而确定其质量。分子生物学中的应用：一、质谱在核酸水平上检测疾病相关基因也是近年来的一个热点。基因变异导致的疾病往往会引起标志基因———SNP的改变,质谱能够测定突变前后的SNP的分子量,通过比较,推定其突变方式。Bunger等人[3]的研究应用质谱分析鸟枪法处理后的SNP编码序列,得到了与疾病相关的蛋白组学的正交分析数据。二、在蛋白质的研究方面,质谱测定内容包括蛋白质的一级结构如分子量的测定、蛋白质组研究、肽指纹图谱测定、肽序列的测定、巯基和二硫键的定位、蛋白质翻译后的修饰等。2别构酶？当某些化合物与酶分子中的别构部位可逆地结合后，酶分子的构象发生改变，使酶活性部位对底物的结合与催化作用受到影响，从而调节酶促反应速度及代谢过程，这种效应称为别构效应。具有别构效应的酶称为别构酶。别构酶的反应初速度与底物浓度（V对[S]）的关系不服从米氏方程。而是呈现S形曲线。S形曲线表明，酶分子上一个功能位点的活性影响另一个功能位点的活性，显示协同效应（cooperativeeffect）,当底物或效应物一旦与酶结合后，导致酶分子构象的改变，这种改变了的构象大大提高了酶对后续的底物分子的亲和力。结