课题2-土壤中分解尿素细菌的分离和计数学案

课题2-土壤中分解尿素细菌的分离和计数学案1/6专题2课题2土壤中分解尿素细菌的分离与计数【基础知识[】一、筛选菌株1.自然界中目的菌株的筛选（1）依据：根据它对的要求，到相应的环境中去寻找。（2）实例：PCR技术过程中用到的耐高温的，就是从热泉中筛选出来的Taq细菌中提取出来的。2.实验室中目的菌株的筛选：（1）原理：人为提供有利于生长的条件(包括等)，同时或其他微生物生长。（2）方法：利用选择培养基分离。a.选择培养基：在微生物学中，将允许种类的微生物生长，同时和其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。b.配制选择培养基的依据根据选择培养的菌种的生理代谢特点加入某种物质以达到选择的目的。例如，培养基中不加入有机物可以选择培养微生物；培养基中不加入氮元素，可以选择培养的微生物；加入高浓度的食盐可选择培养金黄色葡萄球菌等。c.实例：选择分解尿素的细菌的培养基，以作为，只有能合成的微生物才能分解尿素。二、统计菌落数目测定微生物数量的常用方法有和。1.稀释涂布平板法：统计样品中（1）原理:当样品的足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。为了保证结果准确，一般选择菌落数在的平板进行计数。（2）注意事项：课题2-土壤中分解尿素细菌的分离和计数学案2/6a.设置对照：主要目的是排除实验组中对实验结果的影响，提高实验结果的。例如为了排除培养基是否被杂菌污染了，需以培养的培养基作为空白对照。b.设置重复组：同一个稀释度下，至少涂布作为重复组，才能增加实验的说服力与准确性。分析结果时，需要考虑重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验。（3）计算公式：每克样品中的菌株数＝，其中C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数。（4）结果分析：统计的菌落往往比活菌的实际数目。原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是。2.显微镜直接计数法（1）原理：利用特定，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。（2）方法：用计数板计数。（3）缺点：。三、实验设计1、关于土壤中某样品细菌的分离与计数实验操作步骤如下：（1）取样：从富含有机质的土壤中取样。应先3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的中。（2）制备：准备牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。【注意】分离不同的微生物应采用的稀释度：测量土壤中细菌的数量，一般选用104、105和106倍的稀释液进行平板培养；测定放线菌的数量，一般选用103、104和105稀释；测真菌的数量，一般选用102、103和104倍稀释。（3）微生物的与观察将10g土样加入盛有90mL无菌生理盐水的锥形瓶中(体积为250mL)，充分摇匀，吸取上清液，转移至盛有的生理盐水的无菌大试管中，将土样以1、101、102……依次等比稀释至课题2-土壤中分解尿素细菌的分离和计数学案3/6107稀释度，并按照由107～103稀释度的顺序分别吸取进行平板涂布操作。每个稀释度下需要3个选择培养基、1个牛肉膏蛋白胨培养基。将涂布好的培养皿放在30℃温度下培养，及时观察和记录。挑选选择培养基中不同形态的菌落接入含培养基的斜面中，观察能否产生如教材中图2-lO的颜色反应。（4）细菌的计数当菌落数目稳定时，选取菌落数在的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。【思考与讨论】（1）如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数？（2）为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？2.菌种鉴定：（1）原理：分解尿素的细菌合成的脲酶将尿素分解为氨，使培养基的碱性增强，pH。（2）方法：在的培养基中加入指示剂培养细菌，若指示剂变，可确定该细菌能够分解尿素。【例题】【例1】分析下面培养基的配方：KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H20、葡萄糖、尿素、琼脂。请回答：(1)在该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别和。(2)想一想这种培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，又是如何进行选择的？【例2】用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中得到以下几种统计结果，正确的是…()A．涂布了一个平板，统计的菌落数是230B．涂布了两个平板，统计的菌落数是215和260，取平均值238C．涂布了三个平板，统计的菌落数分别是21、212和256，取平均值163D．涂布了三个平板，统计的菌落数分别是2l0、240和250，取平均值233【例3】用来判断选择培养基是否起到了选择作用需要设置的对照是()A．未接种的选择培养基课题2-土壤中分解尿素细菌的分离和计数学案4/6B．未接种的牛肉膏蛋白胨(全营养)培养基C．接种了的牛肉膏蛋白胨(全营养)培养基D．接种了的选择培养基【练习题】一、选择题1．PCR技术要求使用耐高温的DNA聚合酶，这种酶要能忍受93℃左右的高温。如果请你来寻找这种耐高温的酶，你会去哪里寻找………()A．土壤中B．海水中C．热泉中D．冷库中2．下列能选择出分解尿素的细菌的培养基是………………()A．KH2PO4、Na2HP04、MgS04·7H20、葡萄糖、尿素、琼脂、水B．KH2PO4、Na2HP04、MgS04·7H20、葡萄糖、琼脂、水C．KH2PO4、Na2HP04、MgS04·7H20、尿素、琼脂、水D．KH2PO4、Na2HP04、MgS04·7H20、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、水；3.某同学在稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的平均值为234，那么每克样品中的菌落数是(涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL)…()A．2.34×108B．2.34×109C．234D．23.44.在做分离分解尿素的细菌实验时，A同学从对应106培养基上筛选出大约150个菌落，而其他同学只选择出大约50个菌落。A同学的结果产生原因()①由于土样不同②由于培养基污染③由于操作失误④没有设置对照A．①②③B．②③④C．①③④D．①②④5.关于土壤取样的叙述错误的是………()A．土壤取样，应选取肥沃、湿润的土壤B．先铲去表层土3cm左右，再取样C．取样用的小铁铲和信封在使用前不用灭菌D．应在火焰旁称取土壤6.下列关于从土壤中分离细菌的操作步骤中，正确的是…………()①土壤取样②称取10g土壤取出加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中③吸取0.1mL进行平板涂布④依次稀释至101、102、103、104、105、106、107稀释度A．①→②→③→④B．①→③→②→④C．①→②→④→③D．①→④→②→③7.下列关于测定土壤中细菌数量的叙述，正确的是………()A．一般选用103～107倍的稀液分别涂布B．测定放线菌的数量，一般选用103、lO4和105倍稀释C．测定真菌的数量，一般选用103、104和105倍稀释D．当第一次测量某种细菌的数量，可以将101～107倍的稀释液分别涂布到平板上培养8.下列关于微生物的培养叙述错误的是()A．细菌一般在30～37℃的温度下培养1～2dB．放线菌一般在25～28℃的温度下培养5～7dC．霉菌一般在25～28℃的温度下培养3～4d课题2-土壤中分解尿素细菌的分离和计数学案5/6D．不同种类的微生物，一般需要相同的培养温度和培养时间9.下列操作需要在火焰旁进行的一组是()①土壤取样②称取土壤③稀释土壤溶液④涂布平板⑤微生物的培养A．①②③④⑤B．②③④⑤④⑤C．③④⑤D．②③④10.下列可以鉴定出分解尿素的细菌的方法是…………()A．以尿素为唯一氮源的培养基中加人酚红指示剂B．以尿素为唯一氮源的培养基中加入二苯胺试剂C．以尿素为唯一氮源的培养基中加入苏丹Ⅲ试剂D．以尿素为唯一氮源的培养基中加入双缩脲试剂二、非选择题11.统计菌落数目一般用稀释涂布平板法，当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个，来源于样品稀释液中的一个。计数时一般选择菌落数在的平板计数。12.在做本课题实验时，一位同学在稀释倍数为106的培养基中涂布了3个平板，统计的菌落数分别为21、212和256，该同学以这3个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。你认为这一结果是否接近真实值?如果需要改进，如何改进?13.在进行操作本课题实验时应特别注意：、、。14．在做本课题实验时，甲同学筛选出的菌落与其他同学不同，并且他在设计实验时并没有设置对照。思考下列问题：(1)你认为出现甲同学这种结果的原因可能是什么?(2)要帮助甲同学排除可能影响实验结果的因素，需要设置，实验方案有两种：一种方案是可以由其他同学用与甲同学进行实验，如果结果与甲同学一致，则证明甲同学，如果结果不同，则证明甲同学存在操作或的配制有问题。另一种方案是将甲同学配制的培养基在不加的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到。(3)由此问题你得出的启示是什么?参考答案：一、1（1）生存环境（2）Taq酶2（1）目的菌珠营养、温度和pH抑制阻止（2）a、特定抑制阻止b、自养能固氮c、尿素唯一氮源脲酶课题2-土壤中分解尿素细菌的分离和计数学案6/6二、稀释涂布平板法显微镜直接计数法1活菌数目（1）稀释度活菌30-300（2）a、非测试因素可信度无杂菌污染b、3个平板（3）CV×M（4）低一个菌落2（1）细菌计数板或血细胞计数板（3）不能区分死菌与活菌三、1（1）土壤铲去表层土信封（2）培养基多于对照不同（3）培养1ml9ml0.1mL酚红（4）30-300平均数【思考与讨论】1统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计3个平板，计算出平板菌落数的平均值，然后按课本旁栏的公式进行计算2这是因为土壤中各类微生物的数量（单位：株/kg）是不同的，例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为2185万，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。因此，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。四：典例分析2（1）氨碱性升高（2）以尿素作为唯一碳源酚红红【典型例题】【例1】(1)葡萄糖尿素(2)有选择作用。因为此配方中尿素是唯一氮源，因此，只有能够利用尿素的微生物才能够生长。【例2】D【例3】C基础自测一、1．C2．A3．B4．C5．C6．B7．D8．D9．A二、