搜索
槐花米中芦丁的提取分离与鉴定目的要求：1.掌握黄酮（苷）类化合物的预试及预试原理。2.掌握黄酮（苷）类化合物的提取原理和方法。3.掌握黄酮（苷）重结晶精制的原理和方法。4..掌握黄酮苷类化合物酸水解操作原理和方法。5.掌握纸层析、薄层层析定性分析的原理和方法。6.掌握乙酰化反应制备乙酰化物的原理和方法。7.了解熔点测定的意义。掌握熔点测定的原理和操作方法。8.巩固抽滤、重结晶等基本操作。9.掌握苷类成分的一般鉴定程序。药材：豆科槐属植物槐树（SophorajaponicaL.）花蕾。试剂：浓盐酸、Mg粉、1%AlCl3乙醇溶液、3%FeCl3乙醇溶液、10%α-萘酚、浓硫酸、硼砂、新鲜石灰乳、2%硫酸、95%乙醇、水、BaCO3细粉、ZrOCl2溶液、枸橼酸、鼠李糖标准品溶液、葡萄糖标准品溶液、醋酐、GF254、0.5%CMC-Na溶液、芦丁标准品溶液、槲皮素标准品溶液、纸层析展开剂（正丁醇-乙酸-水比例为4:1:5）、纸层析显色剂（苯胺-邻苯二甲酸试剂）、薄层层析展开剂（氯仿-甲醇-加酸比例为15:5:1）、薄层层析显色剂（1%FeCl3-1%Fe（CN）6比例为1:1）。原理：1.碱提酸沉芦丁：芦丁属黄酮类化合物，分子中有较多酚羟基，具弱酸性，易溶于热碱中，酸化后又析出，因此可以用碱溶酸沉碱溶酸沉碱溶酸沉碱溶酸沉的方法提取芦丁，又利用芦丁在冷水和热水中溶解度相差较大的特性进行重结晶精制2.显色反应：黄酮类化合物的颜色反应多与分子中的酚羟基及γ-吡喃酮环有关。A.Mg粉-HCl反应：此为鉴定黄酮类化合物最常用的颜色反应，多数黄酮类化合物显玫瑰红色。B.AlCl3反应：黄酮类化合物或（）等结构可以和Al3+生成黄色络合物，且在紫外下可观察到荧光。C.FeCl3反应：黄酮类化合物中因含有酚羟基，故可产生阳性反应。D.Monish反应：苷在浓硫酸或浓盐酸的作用下脱水产生糠醛及其衍生物，糠醛及其衍生物与α-萘酚作用会形成紫红色复合物，因此在糖液和浓硫酸界面有紫环出现。E.锆-枸橼酸反应：黄酮类化合物分子中有游离的3-OH或5-OH存在时，可与锆盐（ZrOCl2）反应生成黄色的锆络合物，但两种锆络合物对酸的稳定性不同，3-OH、4-酮基络合物的稳定性比5-OH、4-酮基络合物的稳定性强，因此当继续加入枸盐酸后，5-OH黄酮的黄色溶液显著褪色而3-OH黄酮溶液仍呈鲜黄色。2.重结晶：重结晶通常用于杂质含量在5%以下的产品的纯化，是利用样品和杂质在不同温度同一溶剂中溶解度的不同来达到纯化目的。溶剂要求在温度较低时对所需成分溶解度小而在温度高时对所需成分溶解度大，即样品在该种溶剂中的溶解度随温度变化很大。3.槲皮素提取分离：本实验是根据槐花米中芦丁经酸水解成游离的槲皮素和糖，而游离槲皮素不溶于水而以沉淀析出，可经过滤分离。再利用槲皮素易溶于乙醇的性质可对其重结晶精制。4.纸层析法：纸层析是一种分配层析。固定相一般为纸纤维上吸附的水分，流动相为不与水相溶的有机溶剂，混合物各组分在流动相和固定相两种不同溶剂中分配系数差异导致各组分移动距离不同，通过与标准样比对可进行定性分析。5.薄层层析：使利用硅胶对样品中各成分吸附能力的不同以及展开剂对它们解吸附能力的不同，使各成分离，再可通过与标准品的比对达到定性鉴别的目的。6.槲皮素五乙酰化物制备：反应方程式见报告。7.熔点测定的原理及意义：物质自初熔至全熔的温度范围称熔距或熔程。若将毛细管与温度计的水银球紧密靠在一起，则毛细管内被测物质的温度可从温度计上直接读取，这样就可以测出被测物质初熔和全熔时的温度，从而计算出熔距，再与其标准熔距比较，就能鉴别被测物质的纯度，因为纯净的有机物有固定的熔点，熔距很小，仅为0.5～1.0℃，若被测物质含有少量杂质，熔点一般会下降，熔距显著增大。通过测定熔点可以鉴别未知纯粹固态化合物并可根据熔距的长短判断化合物的纯度。操作：1.称取15.5g槐花米粗研碎破壳。取0.5g研碎后的粉末加10ml95%乙醇于70摄氏度水浴15min，过滤，取滤液进行预试反应，结果如下：2.将1.03g硼砂加入300ml沸水中搅匀后，把研碎后的其余槐花米粗粉（15.00g）加入其中，立即用新鲜石灰乳调至PH8，保持此PH微沸30min（需不断补充蒸发掉的水分）。趁热用尼龙布拧挤过滤，得咖啡色滤液250ml，滤液在60-70摄氏度下用浓盐酸调至PH4，放置一周。小心倾倒上清液，抽滤，得泥黄固体，用约230ml沸水将其溶解（逐加法）至饱和，再多加25ml沸水（抛加10%-20%溶剂）以防止热过滤过程中由于温度降低析出固体。溶解过程中溶液颜色变化为：淡黄色浑浊—棕红色微浑浊。趁热过滤除去难溶性杂质，滤液静置自然冷却，抽滤除去易溶性杂质，得淡黄色固体，洗涤，干燥。显色试剂Molish试剂Mg+HClAlCl3FeCl3现象两界面有棕色环红色重叠处黄色加深，且在紫外下有荧光草绿色分结论检品中可能含有糖或苷类化合物检品中可能含有黄酮类化合物检品中可能含有黄酮类化合物，且可能含以下三种结构可能含酚羟基总结论检品中可能含有黄酮苷类化合物3.将烘干的产品称重，描述形状并计算产率。结果如下：名称：黄酮苷纯品性状：黄色片状重量：1.92g产率：12.8%4.称取所得的黄酮苷纯品1.00g，稍加研碎后转入150ml圆底烧瓶中，加入80ml2%硫酸，保持微沸1h，冷水浴冷静置，抽滤，得黄色固体（粗制苷元）和浅黄色澄清滤液（糖液）。5.固体用水至中性，用40ml乙醇-水（1:1）混合溶剂加热回流溶解制成饱和溶液，再抛加8ml（15%-20%）。趁热过滤除去不溶液杂质，滤液用冰水浴静置后抽滤除去可溶性杂质，得苷元纯品，干燥，称重，描述形状并计算产率。结果如下：现象结论溶液颜色变化为淡黄色-黄色加深-橙色，并伴有溶液逐渐澄清；橙色又变为黄色，并出现大量黄色小颗粒。黄酮苷在热水中的溶解度比冷水中大，随着加热而溶解，溶液变澄清；黄酮苷经酸水解后分解产生不溶于水的黄酮苷元，溶液变浑浊。名称：黄酮苷元纯品性状：黄色固体重量：0.41g(理论产量：0.495g)产率：83%6.取20ml糖液用7.10gBaCO3细粉中和至中性，抽滤，得澄清滤液，水蒸汽浴加热浓缩至2-3ml，供纸层析检识用。取糖液与葡萄糖标准品、鼠李糖标准品进行纸层析，结果如下：现象原因BaCO3细粉加入即产生大量气泡；PH调至终点时得黄色浆状物BaCO3+H2SO4——BaSO4+CO2+H2O样点名称比移值Rf比移值差Rf结论葡萄糖标准品0.090.02糖液中可能含葡萄糖和鼠李糖样品点10.11样品点20.300.02鼠李糖标准品0.287.分别取少量黄酮苷纯品、黄酮苷元纯品，分别加5ml95%乙醇，70摄氏度水15min，进行苷及苷元的定性反应，结果如下：试剂HCl+Mg粉Molish试剂ZrOCl2/H+试剂现象黄酮苷醇液红色有红色环黄色较浅，加入枸盐酸后黄色褪去黄酮苷元醇液红色无红色环黄色较深，加入枸橼酸后黄色稍变浅结论苷及苷元都是黄酮类化合物黄酮苷在酸水中发生了水解黄酮苷元分子中有游离的3-OH和5-OH，而黄酮苷分子中只有游离3-OH；苷元的3-OH与糖脱水形成苷键。8.称取GF2542.00g，加入6ml0.5%CMC-Na，混匀，铺板四块并活化烘干。分别取少量苷和苷元于小试管中，加约3ml95%乙醇，60摄氏度水浴2h，供薄层层析点样用。取上述自制样品乙醇液和标准品溶液进行薄层层析，层析条件（展开剂：氯仿-甲醇-加酸比例为15:5:1显色剂：1%FeCl3-1%Fe（CN）6比例为1:1），结果如下：9.制备苷元五乙酰化物。称取0.20g苷元纯品于25ml圆底烧瓶中，加入6ml醋酐和一滴浓硫酸，振摇，80-90摄氏度油浴加热30min，随着加热的进行，固体逐渐溶解，得棕红色澄清溶液，放冷。搅拌下倾入100ml冰水中，搅拌至油滴消失，析出灰色固体，过滤，得浅咖色固体小颗粒。用16.5ml95%乙醇加热回流溶解制成饱和溶液，再2.5ml（抛加15%-20%），趁热抽滤除去不溶性杂质，滤液用冰水浴静置后抽滤除去可溶性杂质，得白色固体，红外灯下干燥，称重，测定熔点，描述形状并计算产率。结果如下：样点名称比移值Rf比移值差Rf结论槲皮素标准品0.740提取所得的黄酮苷很可能为芦丁，黄酮苷水解苷元很可能为槲皮素黄酮苷元样品0.74黄酮苷样品0.120.01芦丁标准品0.11名称：苷元五乙酰化物形状：白色粉末重量：0.20g（理论产量0.399g）产率：50%熔点：MP.190摄氏度-192摄氏度191摄氏度-192摄氏度（文献值MP.192摄氏度-194摄氏度）结论：从两次熔点测定值得准确度和精密度分析可知，苷元乙酰化物中含有少量杂质，且苷元可能为槲皮素。10.综上可得，槐花米中提取物可能为芦丁，其水解产物可能有葡萄糖、鼠李糖、槲皮素。注意事项：1.本实验的关键点在于PH的调节。碱提取时碱液浓度不宜过高，以免在强碱性下，尤其加热时破坏黄酮母核；酸化沉淀时酸性也不宜过强，以免生成羊盐，致使析出的黄酮类化合物又重新溶解从而降低产品收率。2.重结晶制备饱和溶液时要把握好溶剂的量，一般是先配成饱和溶液，再抛加15%-20%溶剂。是否已配成饱和溶液要在近沸点时观察。（本实验利用芸香苷在沸水中的溶解度很大）3.芸香苷在碱液中的溶解度随温度变化很大，要趁热过滤。抽滤时要注意观察抽滤的速度，速度过慢则应分多次进行。未过滤的液体在置于电炉上保持微沸。4.制备苷元五乙酰化物时各装置要干燥。醋酐具有腐蚀性，小心取用。5.熔点测定前样品要充分干燥（杂质水分会影响会使熔点降低，熔距增大）并研细，装填要紧实，装样量约2-3mm。6.注意观察初溶温度，即出现第一滴液滴时的温度。思考：1芦丁提取过程中加入硼砂水的作用：既能形成硼酸/硼酸钠缓冲对从而达到稳定调节溶液PH，又能保护芸香苷分子中的邻二酚羟基不被氧化，亦保护不与钙离子络合，使芸香苷不受损失。实验证明，提取芦丁时加入硼砂，产品质量较好。2.用石灰乳调PH即可达到碱溶解提取芦丁的目的，还可以除去槐花米中大量的黏液质和酸性树脂。3.槐花米粗粉中含有水解芦丁的酶，为防止酶将苷键水解，我们将槐花米粗粉投入沸水中破坏其中的酶的活性而不是将其投入冷水中加热煮沸。4.芦丁的提取方法及其优缺点比较。A.碱提酸沉法——工艺流程：样品粉碎→加蒸馏水→加4%硼砂→加饱和石灰水调ph→微沸提取→过滤→第二次提取→合并滤液→加12%盐酸调ph→静置24小时→过滤→干燥→粗芦丁→煮沸5min→过滤→静置→析出芦丁→过滤洗涤→纯化芦丁最佳工艺条件：槐花中芦丁提取最佳pH值的实验研究优化从槐花中碱提取和酸沉淀的最佳pH值,以提高芦丁的提取效率。在不同pH值的石灰水及盐酸条件下,通过碱提取酸沉淀法从槐花中提取芦丁。研究发现碱提取pH9、酸沉淀pH3时,提纯率可达18.1％。B.乙醇回流法——工艺流程：样品粉碎→加一定浓度的乙醇（固液比一定）→加碳酸氢钠→在设定温度加热回流→过滤→浓缩→加盐酸调ph→加水静置12h→过滤→干燥→粗芦丁→煮沸5min→过滤→静置→析出芦丁→过滤洗涤→纯化芦丁最佳工艺条件：用乙醇水溶液提取芦丁,体积分数为70％的乙醇溶液用量为原料质量的25倍,提取温度70℃,时间3h。C.热水提取法——工艺流程：样品→粉碎→加蒸馏水浸提两次→合并提取液→减压浓缩→芦丁提取液最佳工艺条件：加水量为原料质量的10倍，提取温度为70℃,时间2.5h。D.纤维素酶法——工艺流程：样品→粉碎→加蒸馏水→浸提两次→合并提取液→减压浓缩→芦丁提取液最佳工艺条件：酶解温度45℃，PH值4.5，纤维素酶添加量0.03%，酶解时间2.0h，料液比1：55。分析：碱提酸沉法提取率高，提取时间较短，生产效率较高，成本低廉，特别适合乡镇企业生产，但工艺和热水相比要复杂，特别是其ph值得控制比较困难；用乙醇回流法提取，有机溶剂提取率高,但溶剂成本高，提取时间长，能源消耗大，杂质含量高，由于考虑到有机溶剂不安全,易残留，故不宜利用；热水提取法是最经济、最安全的芦丁提取方法