利用Minitab优化耐高温淀粉酶发酵培养条件

第41卷第5期中南大学学报(自然科学版)Vol.41No.52010年10月JournalofCentralSouthUniversity(ScienceandTechnology)Oct.2010利用Minitab优化耐高温淀粉酶发酵培养条件赵伟，陈晨，刘倩，冯婷婷，周洪波(中南大学资源加工与生物工程学院，湖南长沙，410083)摘要：利用Minitab软件中的Plackett-Burman实验设计和响应面分析法，对耐高温α-淀粉酶产生菌BacillussubtilisC1的发酵培养条件进行优化。在单次单因子法得出的适宜条件基础上，综合考虑所有影响因素，对培养条件进行统计分析，得到BacillussubtilisC1产耐高温α-淀粉酶的最佳培养条件。研究结果表明：优化培养基的组成(200mL)为麸皮2.16g，棉粕粉1.98g，酵母粉0.40g，NaCl1.00g，CaCl20.40g，淀粉0.10g。培养基优化后的酶活为2329U/mL，约是培养基优化前酶活的12.55倍，酶活得到显著提高。关键词：Plackett-Burman设计；响应面分析；Minitab软件；α-淀粉酶中图分类号：Q556+.2文献标志码：A文章编号：1672−7207(2010)05−1652−06Optimizationofmediumforthermostableα-amylasefermentationusingMinitabZHAOWei,CHENChen,LIUQian,FENGTing-ting,ZHOUHong-bo(SchoolofMineralsProcessingandBioengineering,CentralSouthUniversity,Changsha410083,China)Abstract:TheoptimummediumforBacillussubtilisC1wassystematicallystudiedwithMinitabsoftware.Onthebasisofsinglefactorexperiments,theprimefactorsaffectingenzymeactivitywereselectedbymeansofPlackett-Burmandesign.Andthen,thefactorswereoptimizedbyresponsesurfaceanalysis.Theresultsshowthattheoptimalmediumcompositionin200mLculturemediumisasfollows:wheatbran2.16g,cottonseedmeal1.98g,yeastextract0.40g,NaCl1.00g,CaCl20.40g,starch0.10g.Enzymeactivityundertheoptimalcultureconditionsis2329U/mL,whichis12.55timesofthatoftheoriginalmedium.Keywords:Plackett-Burmandesign;responsesurfaceanalysis;Minitabsoftware;α-amylase在纺织工业中，耐高温的α-淀粉酶可以作为退浆酶将织物的浆料退浆除去，并且具有有效、经济、环保等优点[1]。产耐高温α-淀粉酶的菌种有许多，目前，研究和应用较多的是芽孢杆菌属(Bacillus)[2]，常用的是地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheninformis)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、嗜热芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)等。另外，也有关于嗜热细菌和古菌的研究[3]，不过它们最适生长温度较高，多为80℃以上，生长条件较苛刻，并不适合工业化生产的要求。因此，常温菌株芽孢杆菌属(Bacillus)仍然是研究的重点。本实验室通过筛选，获得一株产耐高温α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，命名为BacillussubtilisC1，并对其所产粗酶的相关性质进行了研究。现对其进行进一步研究，以确定其最优发酵条件。Minitab作为世界著名的数据分析软件，具有强大的实验设计(designofexperiments，DOE)功能及数据管理、统计分析等功能[4]。在此，本文作者进行Plackett-Burman实验[5]、最陡爬坡实验[6]和Box-收稿日期：2009−10−15；修回日期：2009−12−28基金项目：国家自然基金创新研究群体科学基金资助项目(50621063)；教育部新世纪优秀人才支持计划项目(NECT-06-0691)通信作者：周洪波(1969−)，男，湖南湘潭人，博士，教授，从事微生物工程研究；电话：[phone]；E-mail:[e-mail]第5期赵伟，等：利用Minitab优化耐高温淀粉酶发酵培养条件1653Behnken等实验[7]，并利用Minitab软件对BacillussubtilisC1发酵生产的相关影响因素进行研究和探索。1材料与方法1.1菌种及培养基菌种由本实验室选育。种子培养基成分为：淀粉1%(质量分数，下同)，蛋白胨1%，酵母粉0.5%，NaCl1%。基础发酵培养基成分为：麸皮1%，棉粕粉1%，酵母粉0.2%，NaCl0.5%。采用500mL摇瓶盛装200mL培养基。1.2粗酶液制备采用三角瓶(500mL)装培养基200mL，接种后于45℃恒温振荡培养48h，在4℃取发酵液于10000r/min离心20min，上清液即为粗酶液。1.3酶活测定采用Yoo改良法测定酶活[8−9]。在20mL试管中加入5mL0.5%淀粉溶液(用pH=6.0磷酸盐缓冲液新鲜配制)，在70℃预热10min。然后加入稀释一定倍数的0.5mL酶液，在70℃准确反应5min后，加入5mL0.1mol/LHCl终止反应。取0.5mL反应液加入盛有5mL0.4mmol/LI2-KI溶液的试管中显色。在波长为620nm处测定吸光度。酶活力单位U定义：在pH为6.0、温度为70℃、于5min水解1mg淀粉所需的酶量。1.4实验设计1.4.1单因素实验采用单次单因素法[10]，假设各因素间不存在交互作用，1次改变培养基的1个因素的水平而其他因素保持不变，然后逐个进行考察优化。作为Plackett-Burman实验的准备，此实验用来确定最佳C源、N源、温度和初始pH、转速等。1.4.2Plackett-Burman实验设计Plackett-Burman实验设计(PBD)[11]被称作筛选实验设计，当实验因素较多时，实验进行不方便，且不考虑交互作用时，才会考虑使用此方法。虽然与其他方法相比，Plackett-Burman实验设计不能区分主效应与交互作用的影响，但可以确定对结果影响显著的因素，从而达到筛选的目的。Plackett-Burman实验对每个因素取2个水平来进行分析，通过比较各因素2个水平的差异与整体的差异来确定因素的显著性。通过Plackett-Burman实验的筛选，能避免在后期的优化实验中由于因素数太多或部分因素不显著而造成的实验资源浪费。利用Minitab软件创建Plackett-Burman实验，每个因素取2个水平。按照传统的实验方式，高水平一般为低水平的1.0~1.5倍。在前期单因素实验获得结果的基础上，本实验选取影响较大的6个因素，即基础发酵培养基的成分：麸皮、棉粕粉、酵母粉、NaCl以及用于稳定酶构象而使酶活增加的CaCl2和诱导物淀粉。其他因素如温度、初始pH、转速等均恒定，选用变量个数N=12的Plackett-Burman设计表，另加3个虚拟变量，用于考察实验误差。各因素所代表参数、水平见表1，实验设计及结果见表2。表1Plaekett-Burman实验设计参数和水平Table1FactorslevelsofPlackett-Burmandesign水平代号因子−11Am(麸皮)/g1.62.4Bm(棉粕粉)/g1.62.4C———Dm(酵母粉)/g0.40.8Em(淀粉)/g0.10.14F———Gm(NaCl)/g1.01.4Hm(CaCl2)/g0.40.6I———1.4.3最陡爬坡实验设计响应面的拟合方程必须在紧接邻域内才近似真实情形，在其他区域，拟合方程与被近似的方程毫无相似之处，几乎无意义；因此，找出主要因素后，必须通过使主要因素同时朝向响应值的最大方向变化，逼近最大响应区间，找出峰值，才能建立有效响应面方程[12]。在最陡爬坡实验中，对酶活影响不显著的其他因素取最低水平，而影响显著的3个因素以实验值的变化方向为爬坡方向，根据各因素效应值与比例来确定变化步长，最快地逼近最佳值区域。1.4.4Box-Behnken实验设计Box-Behnken(BBD)实验设计是一种常用的响应面分析法，用来评价指标和因素间的非线性关系，估中南大学学报(自然科学版)第41卷1654表2Plaekett-Burman实验设计表及结果Table2DesignmatrixandexperimentalresultsofPlackett-Burmandesign序号ABCDEFGHI酶活/(U·mL−1)1−11−1−1−1111−117312−1−1−1−1−1−1−1−1−1194631−111−11−1−1−1218141−1−1−1111−1119975−1−1111−111−116766−1111−111−1116697−1−1−1111−111177181−11−1−1−111121619111−111−11−116541011−11−1−1−11118121111−111−11−1−1152412−111−11−1−1−111567表3Box-Behnken实验设计表及实验数据Table3DesignmatrixandexperimentalresultsofBox-Behnkendesign序号m(麸皮)/gm(棉粕粉)/gm(淀粉)/g酶活/(U·mL−1)12.01.60.12204122.41.60.12218932.02.00.12196442.42.00.12205852.01.80.10218762.41.80.10237472.01.80.14208282.41.80.14225692.21.60.102074102.22.00.102046112.21.60.142119122.22.00.141959132.21.80.122338142.21.80.122301152.21.80.122366计一阶、二阶与一阶交互作用项的多项式模式，是一种有效的响应面设计法[13]。结合前面实验结果，利用Minitab软件创建Box-Behnken实验设计。实验中的3个因素为麸皮、棉粕粉和淀粉，每个因素取3个水平。实验共有15个实验点，其中有12个析因点和3个零点。对零点实验进行3次，以估计误差。Adinarayana等[14]论述了响应面法的主要原理。根据用多项式回归分析对实验数据进行拟合，可得到二次多项式。它是一个描述响应变量(因变量)与自变量(操作条件)关系的模型。2111110ijikjkiiijiijkiiiXXXXY∑∑∑∑−====+++=ββββ(1)其中：Y为预测响应值；β0，βi，βii和βij分别为常量、一次项系数、二次项系数和交互作用系数；Xi为自变量编码，xxxXiiΔ−=/)(0(2)xi为自变量真实值；x0为试验中心点处自变量；xΔ为自变量的变化步长。2结果分析2.1Plackett-Burman实验结果分析利用Minitab对Plackett-Burman实验数据进行分析，结果如表4所示，其标准偏差为61.0410，预测误差平方和为268272，回归方程的系数R2为0.9858；调整后R2为0.9219。第5期赵伟，等：利用Minitab优化耐高温淀粉酶发酵培养条