全血基因组DNA的提取

MolecularBiology分子生物学检验技术分子生物学分子水平研究对象DNA及RNA其表达产物蛋白质探讨生命现象遗传功能关系、作用以超乎想象的速度飞速发展，渗透到医学每一个领域。与临床检验诊断学关系使疾病诊断深入到基因水平基因诊断可以毫不夸张的说，如果没有分子生物学的应用，人类探索生命活动的行为将会寸步难行。分子生物学检验技术的应用本学期实验内容123理论考试占70%，实验成绩占30%实验一全血基因组DNA的提取基因组（Genome）：细胞中一套完整单倍体的遗传物质的总和。原核生物基因组病毒基因组真核生物基因组真核基因组DNA的分离纯化（1）核酸包括DNA、RNA两种分子，在细胞中都以与蛋白质结合的状态存在。（2）真核生物的染色体DNA为双链线性分子；分离核酸注意事项：（1）减少化学因素对核酸的降解。（2）减少物理因素对核酸的降解。（3）防止核酸的生物降解：策略：新鲜生物组织或细胞样品。核酸提取的主要步骤：一般为破碎细胞，去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子，去除其他不需要的核酸分子，沉淀核酸以去除盐、有机溶剂等杂质，最后得到纯化的核酸。一、实验目的与意义（一）目的：掌握全血DNA提取基本技能。（二）意义：基因组DNA含有细胞中全部的遗传信息，从全血中提取DNA是遗传性疾病、胎儿产前无创伤诊断、肿瘤和传染性疾病等的早期确诊的重要手段和技术，DNA提取的质量和产量直接影响PCR扩增、分子克隆、限制性内切酶的酶切反应等试验的成败。（三）常用提取方法：有机溶剂抽提法（氯仿-异戊醇法）盐析法（经典Miller盐析法）NaI法……NaI法提取外周血白细胞DNA，提取的DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列。通过本实验学习和掌握NaI法提取DNA。二、实验原理从全血制备白细胞DNA，可用双蒸水溶胀红细胞及白细胞膜，释放出血红蛋白及细胞核，使核酸处于易提取状态，加NaI破核膜并使DNA从核蛋白中解离，用氯仿/异戊醇抽提使蛋白质沉淀完全，DNA存在于上层水相中，以异丙醇沉淀DNA，离心弃去异丙醇，70%酒精干燥，即可获得白细胞DNA。1、高速离心机。2、全血DNA提取试剂盒（TaKaRa宝生物工程公司）试剂盒组成：GenTLEsolutionⅠ1瓶GenTLEsolutionⅡ2瓶GenTLEsolutionⅢ1瓶3、异丙醇、70%乙醇。三、实验材料各试剂成分作用：GenTLEsolutionⅠ：破坏血细胞同时，与核酸形成电中性的复合体。GenTLEsolutionⅡ：复合体离心收集后清洗，洗涤作用。GenTLEsolutionⅢ：将DNA从核蛋白中解离出来。异丙醇：将DNA沉淀回收。70%酒精：利用DNA不溶于酒精的特性，去除DNA沉淀中残留的盐类分子。四、实验流程与要求新鲜全血的收集全血DNA的提取提取DNA质量的初鉴经各种抗凝剂处理过的全血（EDTA、柠檬酸或肝素）按试剂盒说明书操作。见后1、琼脂糖凝胶电泳初步鉴定；2、测定DNA浓度及纯度；A260/A280比值全血DNA的提取（1）100ul混匀的全血GenTLESolutionI500ul（2）振荡混匀数秒（3）室温放置10min以上（4）12,000rpm离心5min(20℃以上离心)（5）小心去除管中液，枪头不要碰到离心管内壁（防止吸走沉淀物）此时沉淀看不清。（6）加入1mlGenTLESolutionⅡ沿管内侧内壁加入到离心管中轻柔颠倒离心管2-3次，室温12,000rpm离心2min,去除上清。（7）加入500ulGenTLESolutionⅢ轻微振荡10s充分混合。室温12,000rpm离心5min将上清转移至另一个新的离心管中加入等体积（500ul）异丙醇，轻柔颠倒混匀。4℃12,000rpm离心5min，小心去除上清，加入1ml的70%乙醇清洗沉淀，再次4℃12,000rpm离心5min，小心去除上清并干燥沉淀。沉淀的溶解：加入30ulDH2O（或TE缓冲液）。提取DNA质量的初鉴琼脂糖凝胶电泳1.制备琼脂糖凝胶0.3g琼脂糖+30ml0.5×TBE缓冲液，加热至完全溶化且摇匀，温度适宜时加入荧光染料。2.胶板的制备将样品梳插于内槽，并将制胶槽平放在桌上，将冷却至60度的琼脂糖凝胶缓缓倒入槽内，使其形成均一胶面，勿起泡。胶凝固后垂直取出梳子，将制好的胶板置入电泳槽内，并加入电泳缓冲液。3.加样、电泳凝胶电泳操作注意事项1.缓冲系统：注意缓冲液的使用是否正确。2.凝胶的制备：凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致，溶解的凝胶应及时倒入板中，避免倒入前凝固结块。倒入板中的凝胶应避免出现气泡，影响电泳结果。3.样品加入量：加样量的多少依据加样孔的大小及DNA中片段的数量和大小而定，过多的量会造成加样孔超载，从而导致拖尾和弥散，对于较大的DNA此现象更明显。5.电泳系统的变化会影响DNA的迁移，加入DNA标准参照物进行判定是必要的。6.DNA样品中盐浓度会影响DNA的迁移率，平行对照样品应使用同样的缓冲条件以消除这种影响。7.DNA迁移率取决于琼脂糖凝胶的浓度，迁移分子的形状及大小。采用不同浓度的凝胶有可能分辨范围广泛的DNA分子，制备琼脂糖凝胶可根据DNA分子的范围来决定凝胶的浓度。小片段的DNA电泳应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳以提高分辨率。五、实验结果在凝胶成像系统中紫外灯观察拍照（戴手套操作）。DNA存在处显出桔红色荧光条带（EB染料呈现桔红色）。MolecularBiology