化学发光原理及应用

化学发光原理及其应用主要内容化学发光基本原理化学发光分析方法常见化学发光体系及其分析应用PartI.化学发光基本原理一、化学发光原理：伴随化学反应的光发射现象某些物质在进行化学反应过程中，由于吸收了反应产生的化学能而被激发，从激发态返回基态时，发射出一定波长的光，这种吸收化学能使分子发光的过程称为化学发光(chemiluminescence)。化学发光反应存在于生物体(萤火虫、海洋发光生物)中，称生物发光(bioluminescence)。生物发光的本质是化学发光1877年洛粉碱CL1905年洛粉碱类似物1928年鲁米诺1935年光泽精1960sPMT出现发现许多有机反应可产生CL生物体化学发光现象的研究起源于古代，但是，直到十九世纪末，这种现象与简单的有机反应相联系才得到解释。化学反应-G化学发光h荧光产生的原理入射光(h1)激发下的光发射现象化学发光的原理化学反应释放的能量(-G)使基态物质被激发而产生的后续光发射现象入射光h1荧光h2磷光h31.化学发光对应的能级跃迁化学发光包含化学反应、能量传递以及后续激发态弛豫(与荧光一致)三个过程2.化学发光光谱化学发光光谱与发光体的荧光发射光谱具有对应关系化学发光光谱中避免了激发光源的干扰二、化学发光反应发生的条件化学反应是放热反应。化学反应的自由能的变化与发光波长的关系:–Gh/ex2.857×10–4千卡/ex摩尔400~750nm的可见光发射时所需要的G的数值应在38~71千卡(170～300kJ/mol)之间。必须存在形成电子激发态的通道。激发态分子必须以辐射光子的形式回到基态,或将能量传递给荧光分子。能量，通道，荧光物质2.化学发光反应直接化学发光A+BC*+DC*C+h1间接化学反应发光A+BC*+DC*+FF*+CF*F+h2+H2O2OCCOOO+2ArOHOCCOOOArArOCCOOO(CO2)2*2CO2+h1OCCOOO-.F+.F*+2CO2F*F+hOCCOOO+FOCCOOO-.F+.***电致化学发光现象电致化学发光(ECL)是通过在电极上施加一定波形的电压或电流信号进行电解反应的产物之间或与体系中共存组分反应产生化学发光的现象。多环芳烃化合物具有电致化学发光的特性9,10-二苯基蒽,将200Hz左右的方波电位(+1.3-2.2Vvs.SCE)加到电极DPA-e→DPA.+(+1.3V)DPA+e→DPA.-(-2.2V)DPA.++DPA.-→1DPA*+DPA1DPA*→DPA+hν(λ=512nm)+1.3V-2.2V三、化学发光的表征光谱：仅取决于体系的激发态动力学曲线（反应时间）化学发光强度化学发光强度取决于发光过程的量子产率(cl)反应速率(dc/dt)量子产率：凡是影响激发态荧光量子产率的因素都将对化学发光的量子产率产生影响影响化学发光反应速率的物质也将影响体系化学发光的强度tctIddclcl灵敏度高，响应的物种数多，但是选择性差PartII.化学发光分析法使[R]过量CA(t)=CA0e-ktIcl(t)=clV=clkCA(t)=clkCA0e-kt尽管A物质的CA0各不相同,但I达到Imax的时间相同.e-k’t为常数.Icl(t)CA0定量分析的依据R+AB+h—dcAdtk[R][A]V==任何对此过程产生影响的物质浓度都可能用化学发光法测定一、化学发光分析法原理二、化学发光分析法流路1.分立式进样化学发光仪PMTR1R2s这类仪器适合于选择性好,量子效率高或发光体寿命长的化学发光反应的监测。不适用于快速化学发光反应(15S)的重现性监测。暗室2.流动注射进样化学发光仪几乎适用于所有15s的快速化学发光反应并且可以增加合适的延迟流路或采用停流技术以适应长寿命的化学发光反应，所得的化学发光强度可以随时间积累样品samplewastePMTrecorder蠕动泵流通池(flowcell)试剂瓶暗室3.HPLC-CL联用技术流动相A流动相B高压泵高压泵混合器进样阀色谱柱试剂1试剂2混合器混合反应DAD检测器废液滤光片流动池光电倍增管记录将化学发光高灵敏度的特点与HPLC高分离效率的优势结合，可以应用于复杂体系中多种痕量物质的定量分析，一般不需要复杂的衍生过程暗室PartIII.常见化学发光体系及其分析应用鲁米诺化学发光体系吖啶酯类化学发光体系过氧化草酸酯类化学发光体系无机物化学发光体系碱性高碘酸钾酸性高锰酸钾酸性硫酸铈稀土配合物(中性)其他化学发光体系一、鲁米诺(luminol)化学发光体系量子产率：0.15～0.05氧化剂:H2O2O2KMnO4NaClOI2[Fe(CN)6]3-.催化剂:过氧化酶氧化血红素过渡金属离子(Cu2+、Mn2+、Co2+、V4+、Fe2+、Fe3+、Ni2+、Ag+、Au3+、Hg2+etc.)间接测定：在生物酶作用下与O2生成H2O2的葡萄糖和氨基酸以及相应的酶OXIDANTBASEluminol*3-Aminophthalate+h3-APA1.化学发光原理－氧化还原型max=425nm2.邻菲罗林(1,10-phenanthroline)NNCHONNCHO+H2O2+hv氧化剂:H2O2催化剂:Cu2+Co2+Pb2+Fe3+Ni2+抑制剂:蛋白质与Cu2+形成络合物二、吖啶酯类化学发光体系代表性物质：光泽精(lucigenin)NCH3NCH3++.2NO3-OxidationOH-NOCH3*NMA+LIGHTLucigeninN-METHYLACRIDONE(NMA)氧化剂：H2O2；还原剂+O2还原剂：乳酸尿酸抗坏血酸催化剂：过渡金属离子、酶抑制剂：酚类物质对此反应有抑制作用间接测定：能够生成H2O2的基质及相应的酶max=445nm量子产率高，易于标记，是发展化学发光免疫分析和DNA发光探针的重要标记物三、过氧化草酸酯(TCPO)类化学发光体系+H2O2OCCOOO+2ArOHOCCOOOArArOCCOOO(CO2)2*2CO2+h1OCCOOO-.F+.F*+2CO2F*F+hOCCOOO+FOCCOOO-.F+.化学发光原理－能量传递型氧化剂：H2O2背景发光：max=440nm,550nm发射波长：取决于共存荧光物质四、碱性高碘酸钾化学发光体系IO4+O2+2OH2O2+IO3+H2OˉˉˉO2+CO32ˉˉCO3+O22ˉˉˉ(1)(2)(5)**4O2ˉnanogold(O2)2*+2H2O2+4OH2CO3ˉ(CO2)2*+O222O2(λ=490~500nm)(O2)2*+hν+4H2Oˉ2CO2(λ=430~450nm)+hνˉ(3)(4)(6)nanogold(CO2)2*氧分子对的发射：490~500nmCO2双分子发射：430~450nm化学发光原理－活性氧中间体型林金明AnalyticalChemistry2002多酚类物质对该体系的化学发光有增强作用五、酸性高锰酸钾化学发光体系1.KMnO4–还原剂CL体系KMnO4+Red—Intermediate(激发态)—直接CLFluorophoreFluorophore(激发态)—间接CL还原剂：氨基酸、SO2、碘、药物、毒品等具有还原性的物质量子产率不高，可以加入强还原性物质增强体系灵敏度可以测定化学需氧量Talanta2003,61,651-658六、其他化学发光体系1.高价铈CL体系ChemiluminescenceofCe(IV)andsurfactantTween20Analyst,2001,126,553一些多酚类和胺类物质对该体系有增强和抑制作用OrganicCompounds*OrganicCompounds*Salicylicacid+773Chlorogenicacid+31Sulphosalicylicacid+797Ascorbicacid+282,4-Dihydroxybenzoicacid+5572,4-Dinitrophenol**Phloroglucinol+408Benzoicacid**m-Nitrophenol+326Tannicacid-88Resorcinol+296Gallicacid-91p-Hydroxybenzoicacid+2764-t-Butylpyrocatechol-92o-Nitrophenol+115Pyrogallol-127Phenol+96Dopamine-42Rutin+80Aniline**Catechol+73p-Phenylendiamine**3,4-Dihydroxybenzoicacid+692.气相CL体系JournalofChromatographyA,842(1999)267–308以N的氧化物为例O3+NOO2+NO2*NO2*NO2+hv(=600–2800nm)Lightintensity[NO]MeasurementofNO23NO2+Mo3NO+MoO3(reduction)TotalNO(initial+reducedNO2)=NOx[NO2]=[NOx]–[NO]450C(Catalyst)臭氧法测定N的氧化物能够与臭氧反应产生化学发光的物质：不饱和脂肪烃和芳香族化合物；含有N，S等杂原子的化合物；卤代有机酸和卤代烷烃；N的氧化物和CO；金属有机化合物；细菌。3.萤火虫发光(fireflyBL)Luciferin+ATP+O2luciferaseAMP+Oxyluciferin+hvmax=562nm此反应重要的分析对象是ATP10-11~10-14mol4.细菌发光(bacterialBL)FMNH2+O2+RCHOluciferaseFMN+RCOOH+H2O+hvFMN+NADHNADH脱氢酶FMNH2+NAD还原型吡啶核苷酸黄素主要分析物FMN10-12mol此反应常用于NADH和NADPH试验10-15molmax=490nm5.化学发光免疫分析竞争法：（检查小分子抗原多采用）启动发光试剂Ag+Ag-L+AbAg-Ab+Ab-Ag-L—————h首先将待测抗原与CL标记的抗原混合均匀，再与抗体发生竞争反应结合，并将未被吸附的抗原洗掉。由于抗体的浓度已知，标记抗原的浓度可以由化学发光强度测定，二者的差值即被测抗原的浓度。化学发光免疫分析仪本章小结：化学发光分析的特点不需要外部光源：消除了入射光的干扰(瑞利散射和拉曼散射)。克服了光源不稳定而导致的波动的缺点，降低了噪声，提高了信噪比。灵敏度高(通常可达ng级或pg级)。线性范围宽(通常可达三个数量级)。设备简单、分析快速、易实现自动化。局限性：方法选择性较差、发光体系相对较少、仪器商品化不够无机物无机离子N的氧化物含S化合物有机物烃、多环芳烃醇、多酚、醛、酮、酸、酯杂环化合物和生物酶聚合物活性氧纳米粒子：半导体纳米量子点和金属纳米粒子本章小结：化学发光法的分析对象直接发光增强抑制作用