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第一节化妆品原料的微生物检验化妆品原料种类很多，性能各异，根据其性能和用途，大体上可分为基质原料和添加剂（辅助原料）。基质原料是组成化妆品的主体或在该化妆品内起主要功能的物质，主要包括油脂、蜡类、粉类、胶质类、表面活性剂、防腐剂、抗氧化剂等。添加剂是赋予色、香及其他特定作用的物质，大多为天然的含有营养成分或生物活性的物质，这些成分又是微生物生长繁殖的良好营养源，在一定程度上成为微生物的培养基，因此，检验原料中的微生物很重要。一、指标菌及特定菌的选择一般原料的微生物指标菌同化妆品成品即：菌落总数、粪大肠菌群、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、霉菌和酵母菌。粉类原料大多数是由土壤矿物质加工而成，而土壤受微生物污染严重。据资料报道，土壤中的致病菌有需氧的炭疽杆菌和厌氧的破伤风杆菌、产气荚膜杆菌等，其检出率很高，产气荚膜杆菌几乎达100%，恶性水肿杆菌64%，破伤风杆菌29%，肉毒杆菌6%。这些致病菌能在土壤中生存较长时间，例如炭疽杆菌的芽孢能生存15年之久；肠道致病菌可生存100～170d；结核杆菌能生存1年左右；破伤风杆菌芽孢和产气荚膜杆菌也能长期在土壤中生存。在滑石粉、高岭土、碳酸钙等粉类原料中，经常检出枯草杆菌、真菌等，因此，在粉类原料中可增加需氧芽孢杆菌、产气荚膜杆菌和破伤风杆菌指标。在某些生物性原料如动物内脏及其提取物等可增加沙门氏菌指标。二、样品的预处理根据原料性质的不同，选用相应的预处理方法，如油质类原料可按油性或疏水性（油包水）化妆品处理，粉类原料按粉剂化妆品样品处理等。三、检验方法各种微生物的检验方法均与化妆品成品检验方法相同，可参见《化妆品卫生规范》中微生物检验方法。原料与成品微生物检验方法最根本的不同点是检验原料所用的稀释液和培养基中都不含有中和剂（卵磷脂和吐温-80）。如检验菌落总数用普通营养琼脂培养基，绿脓杆菌增菌培养液可用普通肉汤，金黄色葡萄球菌增菌培养液用含7.5%氯化钠肉汤，稀释液均用生理盐水。四、培养基（1）营养琼脂成分：蛋白胨20g琼脂15～20g牛肉膏5g氯化钠5g蒸馏水1000mL制法：将上述成分混合后，加热溶解，调PH值为7.4～7.6,121℃、20min高压灭菌，储存于冷暗处备用。（2）7.5%氯化钠肉汤成分：肉汤100mL氯化钠7.5g制法：将上述两种成分混合均匀，分装，115℃、20min高压灭菌。第二节化妆品生产用水的微生物检验方法水在化妆品的生产中用量极大，是化妆品的主要成分之一，水的品质对化妆品的质量有着重大影响。化妆品生产用水的处理一般采用过滤吸附法、电渗析法、离子交换法等，对生产用水的微生物检测指标有菌落总数、粪大肠菌群、霉菌和酵母菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌。一、菌落总数菌落总数是指水样在一定条件下（营养琼脂培养基，37℃,24h）需氧培养后1mL水样中所含菌落数。检验方法介绍如下。（1）以无菌操作灭菌吸管吸取1mL充分混匀的水样，加到灭菌的平皿内，注入约15mL已融化并冷却到45℃左右的营养琼脂培养基，并立即旋转平皿，使水样与培养充分混匀。每次检验时应做一平行接种，同时另用一个平皿只倾注营养琼脂培养基作为空白对照。（2）待冷却凝固后，翻转平皿，使其底面朝上，置于（36±1）℃培养箱内培养24h,进行菌落计数，即为1mL水样中的菌落总数，以（CFU/mL）报告结果。二、粪大肠菌群粪大肠菌群是作为粪便污染指标菌提出的，是指一群在44.5℃培养24h能发酵乳糖产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。粪大肠菌群数的高低，表明了粪便污染程度，也反映了对人体健康潜在危害性的大小，是评价化妆品生产用水卫生质量的重要指标之一。因生产用水的洁净度较高，可采用滤膜法检测，即将水样通过孔径为0.45μm的滤膜过滤，细菌被阻留在膜上，将滤膜贴在MFC培养基上，44.5℃培养后，计数典型菌落。MFC培养基成分：胰胨10g胆盐3号（BilesaltNo.3）或混合胆盐1.5g多胨5g酵母浸膏3g琼脂15g氯化钠5g苯胺蓝0.2g乳糖12.5g蒸馏水1000mL配制方法：在1000mL蒸馏水中先加入玫红酸（10g/L）的氢氧化钠溶液［c(NaOH)=0.2mol/L］10mL,混匀后，取500mL加入琼脂煮沸溶解，于另外500mL蒸馏水中，加入除苯胺蓝以外的其他试剂，加热溶解，倒入已溶解的琼脂，混匀调节PH值为7.4,加入苯胺蓝煮沸，迅速离开热源，待冷却至60℃左右，制成平板，不可高压灭菌。制好的培养基应存放于2～10℃环境下，不超过96h。EC培养基成分：胰蛋白胨20g磷酸氢二钾4g乳糖5g磷酸二氢钾1.5g胆盐3号（BilesaltNo.3）或混合胆盐1.5g氯化钠5g蒸馏水1000mL配制方法将上述成分溶解于蒸馏水中，115℃高压灭菌20min,冷却至60℃左右时，倾注平皿，备用。检验方法：（1）滤膜和滤器的灭菌将滤膜放入烧杯中，加入蒸馏水，置于沸水浴中煮沸灭菌3次，每次15min,前两次煮沸后需更换水洗涤2～3次，以除去残留溶剂；滤器可用点燃的酒精棉球火焰灭菌，也可用高压灭菌。（2）水样过滤用无菌镊子夹取灭菌滤膜的边缘，贴放在滤床上，固定好滤器，100mL水样，在负0.5atm(1atm=101.325kPa)下抽滤。（3）将滤膜截留细菌面朝上，贴放在MFC培养基上（中间不得有气泡），将平皿倒置于44.5℃培养箱中培养24h。粪大肠菌群菌落为蓝色，非粪大肠菌群菌落为灰色至奶油色。（4）将可疑菌落接种于EC培养基上，44.5℃培养24h,如产气则证实为粪大肠菌群。（5）结果计算粪大肠菌群数（CFU/100mL）＝（经证实粪大肠菌群菌落数×100）/过滤的水样体积（mL）三、霉菌和酵母菌霉菌和酵母菌广泛分布于自然界中，也可存在于水中，可引起化妆品变质发霉，有些霉菌还可产生有毒毒素，所以控制生产用水中的霉菌和酵母菌极为重要。在固体培养基上，霉菌呈放射状生长，孢子有各种颜色；酵母菌在培养基表面多呈圆形凸起，边缘整齐，表面光滑湿润，在培养基深部生长的酵母菌多呈铁饼形、三角形或多角形，在虎红培养基上呈粉红色。检验方法：（1）吸取1mL水样、1/10稀释水样各1mL,分别注入灭菌平皿中，每个稀释度各用2个平皿，注入融化并冷却至45℃的虎红培养基，充分摇匀，凝固后倒置于28℃培养箱培养72h,计数平板内生长的霉菌和酵母菌数，如有霉菌蔓延生长，可于48h时将此平板取出计数。（2）计数方法霉菌和酵母菌菌落数（CFU/mL）：每个稀释度的平均菌落数×稀释倍数四、绿脓杆菌检验方法（1）将过滤器和滤膜灭菌备用。（2）过滤100mL水样，将截留细菌的滤膜置90mL肉汤培养基中，置37℃培养18～24h,如有绿脓杆菌生长，培养液多呈黄绿色或蓝绿色，表面有一层薄菌膜。（3）分离培养、染色镜检、氧化酶试验、绿脓菌素试验、硝酸盐还原产气试验、明胶液化试验、42℃生长试验操作过程可见化妆品绿脓杆菌检验方法。（4）结果报告被检水样经增菌分离培养后，经证实为革兰氏阴性杆菌，氧化酶及绿脓菌素试验阳性，即可报告被检水样中每100mL中检出绿脓杆菌；或绿脓菌素试验阴性而液化明胶、硝酸盐还原产气和42℃生长试验三者皆为阳性时，也可报告被检水样中检出绿脓杆菌；反之，可报告100mL水样中未检出绿脓杆菌。五、金黄色葡萄球菌检验方法（1）将过滤器和滤膜灭菌备用。（2）过滤100mL待检水样，将截留细菌的滤膜置于90mL7.5%氯化钠肉汤培养基中，置于37℃培养箱培养24h。（3）用接种环挑取增菌培养液，划线接种在Baird-Parker氏培养基或血琼脂培养基上，置37℃培养箱培养24～48h。（4）如有典型菌落生长，可进行染色镜检、甘露醇发酵试验、血浆凝固酶试验（详见化妆品中金黄色葡萄球菌的检验方法）。（5）结果报告凡在上述选择平板上有可疑菌落生长，经染色镜检，证明为革兰氏阳性葡萄球菌，并能发酵甘露醇产酸，血浆凝固酶试验阳性，可报告100mL水样中检出金黄色葡萄球菌；否则报告100mL水样中未检出金黄色葡萄球菌。第三节生产车间空气中的微生物检测化妆品生产车间的空气洁净度直接关系到化妆品的质量，所以建立常规的车间空气质量监测系统，及时进行空气净化，可有效保证化妆品达到卫生要求。空气中细菌总数是空气微生物污染最主要的指标菌之一，常用的检测方法有撞击法采样检测和自然沉降法采样检测。一、撞击法采用固体撞击式空气微生物采样器采样，通过抽气动力，使空气高速通过狭缝或小孔，悬浮在空气中的带菌粒子因惯性作用而撞击到培养基平板上，经37℃、48h培养后，计算出每立方米空气中所含的细菌菌落数。所需仪器和设备有撞击式空气微生物采样器及其他检验微生物常用设备。所用培养基为普通营养琼脂培养基。检测步骤（1）选用对空气中细菌捕获率大于95%且性能稳定、便于消毒的撞击式空气采样器。（2）选择有代表性的位置设置采样点，将采样器按操作说明安装、消毒，根据空气污染情况确定采样量，进行采样。（3）采样完毕后，将带菌平板倒置于37℃培养箱内48h,计数菌落数，根据采样流量和采样时间，换算成每立方米空气中的菌落数，以（CFU/m3）报告结果。二、自然沉降法自然沉降法是利用空气微生物粒子的重力作用，在一定时间内将微生物粒子收集到带有培养基的平皿内，在适宜的温度下培养生长成为菌落并进行生物学观察、计数和评价。本方法较撞击法经济简便，不需特殊采样器，但此方法的检测结果受空气气流和带菌颗粒大小的影响较大，所收集的只是一部分较大的微生物粒子，采样条件难以控制。检测步骤（1）根据待测空间大小及通风口的位置选择有代表性的点采样，通常设5个或3个采样点，采样高度为1.2～1.5m,采样点应离墙1m以上，并避开空调、门窗等空气流通处。（2）将直径9cm的营养琼脂平板置于采样点处，打开皿盖，暴露10～30min（根据空气的洁净度）后，盖上皿盖，翻转平板，置于37℃培养箱内48h,计数每皿的菌落数，计算出平均菌落数，以（CFU/m3）报告结果。此结果不能同撞击法结果换算。第四节化妆品生产设备及环境物体表面微生物检验一、生产设备的采样储存罐、灌装机、输送管道等，用灭菌生理盐水棉拭子，在上述设备内侧相对面各25cm2(5cm×5cm)面积范围，来回均匀涂抹，并转动拭子，剪去手接触部位后，将棉拭子放入10mL生理盐水试管内振打80次，根据细菌的污染程度，可作适当稀释，取2mL分别注入两块平皿，每皿1mL,倾注普通营养琼脂，置37℃培养48h，进行活菌计数，计算被检设备表面污染细菌的数量，如检验机器的沟缝等处时，将机器拆卸，直接用棉拭子涂抹，涂抹面积可因被检物的形状及大小而定。生产设备表面污染细菌菌落总数（CFU/cm2）＝平均菌落数×稀释度×采样面积（cm2）×10凡接触化妆品原料和半成品的设备、工具、管道必须用无毒、无害、抗腐蚀材料制作，内壁应当光滑，便于清洁和消毒。所有生产设备、工具在使用前后应当彻底清洁、消毒。二、操作台采样在台面对角线高两点（工人操作处），各25cm2面积，用灭菌生理盐水棉拭子，来回均匀涂抹，并转动拭子，剪去手接触部位后，将棉拭子放入10mL生理盐水试管内振打80次，根据细菌的污染程度，可作适当稀释，取2mL分别注入两块平皿，每皿1mL，倾注普通营养琼脂，置37℃培养48h，进行活菌计数，计算操作台表面污染细菌的数量。操作台表面污染细菌菌落总数（CFU/cm2）＝平均菌落数×稀释度×采样面积（cm2）×10三、检验方法对上述设备如需检验致病菌时，可将涂抹采样的棉拭子放入10mL肉汤管中，置37℃培养18h～24h，检验绿脓杆菌时可划线接种到十六烷三甲基溴化胺或乙酰胺琼脂平板，以下步骤同化妆品绿脓杆菌检验；检验金黄色葡萄球菌时，可划线接种到血琼脂平板或Baird-Parker琼脂平板，以下步骤同化妆品金黄色葡萄球菌检验；检验粪大肠菌群，可将棉拭子连同生理盐水倒入10mL双倍浓度的乳糖胆盐培养基中，以下步骤同化妆品粪大肠菌群检验。