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宏基因组研究在肠道微⽣生物中的最新研究应⽤用报告⼈人：樊⽟玉才12014.06迪康⾦金诺NGS应⽤用交流会组织单位：江苏省⽔水产动物营养重点实验室南京迪康⾦金诺⽣生物技术有限公司2⼤大纲什么是宏基因组研究宏基因组研究的分析流程宏基因组研究的相关应用3什么是宏基因组研究？⽆无需培养，直接从环境样品中提取全部微⽣生物的DNA,结合⾼高通量测序来研究样品中的微⽣生物组成及群落功能。4宏基因组研究热点MetaHIT •MetagenomicsofHumanIntestinalTract•⼈人类肠道宏基因组计划•HMP•HumanMicrobiomeProject•⼈人类微⽣生物组计划•GOS•GlobalOceanSamplingexpedition•全球海洋调查•EMP•EarthMicrobiomeProject•地球微⽣生物计划5宏基因组研究的分析流程提取环境样本DNA获取测序数据⽣生物信息学分析6提取环境样本DNAPowerFecal®DNAIsolationKitPowerSoil®DNAIsolationKitPowerWater®DNAIsolationKit宏基因组测序:•浓度≥50ng/ul;•OD260/280:1.8-2.0;•DNA两次需要量:≥3ug7⽣生物信息分析（⼀一）数据质控数据质量GC含量1)去除接头污染和低质量数据2)去除宿主污染对测序数据的客观评价8⽣生物信息分析（⼆二）：物种组成(16S/18S/ITS)1:物种丰度2:样本聚类129多样性曲线PcoA分析⽣生物信息分析（⼆二）：物种组成(16S/18S/ITS)10代谢通路分析⽣生物信息分析（三）基因功能分析11COG注释CAzyme注释⽣生物信息分析（三）基因功能分析12⽣生物信息分析（四）个性化分析（组数≥2,每组样品数≥10)1)筛选与样品分组显著相关因⼦子(基因、功能)2)基于筛选因⼦子对样品进⾏行主成分分析(PCA)3)基于筛选因⼦子对样品进⾏行聚类分析13⼤大纲什么是宏基因组研究宏基因组研究的分析流程宏基因组研究的相关应用14研究案例（⼀一）Science：⽜牛胃中微⽣生物酶可⽤用于开发⽣生物燃料背景：纤维素是⾃自然界中最丰富的碳⽔水化合物资源。⽜牛在反刍过程中涉及到纤维素的分解，研究⽜牛的消化机制，有利于寻找应⽤用于⽣生产⽣生物燃料的酶。15研究思路将柳枝稷样品置于⽜牛的瘤胃中培养72⼩小时，然后对附着在柳枝稷样品上的所有微⽣生物进⾏行基因组分析。IlluminaGAIIx＋IlluminaHiSeq2000测序建库：200,300,3k,5k双端测序：2*125、2*200、2*75瘘管奶⽜牛16研究结果总共识别了27,755与碳⽔水化合⽔水物绑定模块或具有催化功能的候选基因17后续实验选取233个候选基因，通过设计特定引物，然后使⽤用PCR扩增，其中158of233(68%)得到了扩增产物。随后将扩增产物通过载体（选择90个候选基因）导⼊入⼤大肠杆菌，然后由这些细菌产⽣生了90种蛋⽩白质酶，其中51of90(57%)具有酶活性18研究案例（⼆二）：宏基因组和宏转录组背景：反刍动物排放的CH4是温室⽓气体的重要来源之⼀一⽺羊排放的甲烷⽓气体量存在差异性应用宏基因组与宏转录组测序发现两组之间是否存在差异性19研究思路⾼高通量测序：SSUrRNAgenesequencing：454pyrosequencing测序：IlluminaHiSeq2000insertsizeof250bp、8kb2×150bppair-end样本收集：4highest,4lowest,and2intermediateCH4yieldstwoseparatetimes(20samplestotal)20研究结果应用宏基因组分析，没有发现物种差异性21宏基因组vs宏转录组(A)CO2/H2甲烷⽣生成代谢通路.(B）基因丰度.(C)转录本表达差异.（D）转录本种类差异分析；RPM,readspermillion.NS,nostatisticalsignificanceinWilcoxonrank-sumtest;*,P0.05;**,P0.01;Errorbarsdenotestandarderrors.22研究案例（三）Gut：运动可能增加肠道菌群多样性Clarke,S.F.,etal.,Exerciseandassociateddietaryextremesimpactongutmicrobialdiversity.Gut,2014.背景：研究表明，肠道菌群多样性的减少与肥胖及其他健康问题相关，⽽而肠道菌群多样性的增加则有利于新陈代谢和免疫。运动可能对肠道菌群的多样性产⽣生有益影响。23研究思路样本收集：40名专业橄榄球运动员；此外还有23名是正常BMI组（BMI≤25），23名则属于⾼高BMI组（BMI≥28）46个样本作为对照组。(肠道样本和⾎血液样本)⾼高通量测序：454GenomeSequencerFLXplatformampliconsequencingofthe16SrRNAgeneV4平均⾝身体质量指数（BMI），⽤用于衡量体重指标，运动员组被试的平均⾝身体质量指数（BMI）是29.124研究结果：微⽣生物多样性⽐比较PhylogeneticdiversityShannonindexSimpsonChao1Observedspecies25研究结果：蛋⽩白质摄⼊入量与菌群的关系蛋⽩白质的贡献率在运动员组中（22％）也远⾼高于在对照组中的贡献率（15-16％）26Nature：营养不良破坏你的微⽣生物组⼈人类肠道菌群建⽴立于幼⼉儿时期，这些菌群对⼉儿童的健康有着重要的影响。研究案例（三）27StudySubjectsNumberoffecalsamples50HealthyChildren(Singletons,Twinsand996Mothers&Fathers243SevereAcuteMalnutritionRandomizedClinical589ModerateAcuteMalnutritionCross-Sectional22ConcordantHealthyMalawianTwinsandTriplets471897⾼高通量测序：IlluminaMiSeqplatformV4-16SrRNAsequencingpaired-end162-or250bp研究思路样本收集：50名健康的孟加拉贫民区⼉儿童（25singletons,11twinpairs,1setoftriplets),2岁前每两个⽉月采集⼀一次粪便28研究结果1.按照序列相似性97%来划分总共识别了1,222OTUs2.挑选出了24种差异性表达物种29b:应⽤用随机森林程序，拟合时间与微⽣生物年龄之间的关系cd：营养不良⼉儿童的肠道菌群组成不符合其真实年龄ef:即使通过饮⾷食治疗也⽆无法根本改变30⽂文章推荐：宏基因组与PM2.52014年1⽉月23⽇日,清华⼤大学朱听课题组利⽤用⾼高通量测序技术⾸首次在“种”的⽔水平上鉴别出⼤大⽓气悬浮颗粒物中的微⽣生物.研究发现其中⼤大部分为⾮非致病性微⽣生物,并且有很多可能来⾃自于⼟土壤;同时,他们发现了致敏与致病物种,并且发现它们的相对丰度与污染程度之间呈正相关。31⽂文章推荐：宏基因组与抗⽣生素医院种各种细菌之间的抗性因⼦子可以互相传递。⽣生活在⼟土壤中的天然细菌拥有⼤大量的抗⽣生素抗性基因，但它们很少分享这些基因。⼟土壤中的抗⽣生素抗性基因与特定细菌种属捆绑在⼀一起32⽂文章推荐2014年6⽉月4⽇日的《新英格兰医学杂志》2013年8⽉月29⽇日，宏基因组与肥胖2012年10⽉月4⽇日，宏基因组与2型糖尿病33Thankyou!