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Bacteriophage汇报人：孙建金丽颖果马噬菌体概念噬菌体是感染细菌、真菌、放线菌、螺旋体等微生物的病毒，只能在活的微生物细胞中复制增殖。附在细菌上的噬菌体•噬菌体噬菌体发展简史1896年，英国细菌学家Hankin发现了水中存在抗细菌现象，并认为有种不明物质引起了这种现象。1915年，英国Twort在葡萄球菌中发现噬菌体。1917年，加拿大人F.d，Herelle在法国巴斯德研究所又独立发现痢疾杆菌噬菌体。噬菌体发展简史现象：本来混浊的菌悬液经一夜振荡培养后反而变清。为了弄清原因，他把变清的培养液用细菌过滤器过滤，并把滤液滴在痢疾杆菌菌液里，奇怪的现象再次发生。他还建立了空斑滴定法，此法简单，方便准确。至今仍是定量测定噬菌体浓度的有效手段，而且为动物病毒定量滴定所借鉴，建立了病毒空斑滴定法。个体微小、可通过细菌滤器无细胞结构专性细胞内寄生分布广泛有抗原性可刺激机体产生抗体能够抵抗热、低温、冰冻等噬菌体的化学组成核酸：头部核心，DNA或RNA作用：噬菌体的遗传物质蛋白质：头部外壳和尾部作用：保护核酸构成外壳和尾部噬菌体的化学组成•噬菌体的一些结构蛋白噬菌体的分类按照基本形态可划分为三类：蝌蚪状（T4）、微球状（∮x174）和丝状（M13）。根据噬菌体结构的不同可将其分为：123无尾部结构的二十面体有尾部结构的二十面体线状体噬菌体的分类•迄今已知的噬菌体大多数是有尾部结构的二十面体，到目前为止，研究者至少对5568种噬菌体进行了电镜观察，绝大多数(占96.2%)为有尾噬菌体。噬菌体分类按遗传物质类型进行划分：线状双链DNA（多数）1.DNA噬菌体：环状单链DNA（少数）线状单链RNA（多数）2.RNA噬菌体：线状双链RNA（少数）噬菌体分类根据噬菌体与宿主的关系：（1）烈性噬菌体：指感染宿主细胞后，能够使宿主细胞裂解的噬菌体。（2）温和噬菌体：噬菌体感染细胞后，将其核酸整合到宿主的核DNA上，并且可以随宿主DNA的复制而进行同步复制，在一般情况下，不引起寄主细胞裂解的噬菌体。噬菌体侵染细菌实验烈性噬菌体侵染细菌的过程（1）吸附（2）注入（3）增殖（4）装配（5）裂解噬菌体侵染细菌实验噬菌体的侵染实验的结果证明了DNA是遗传物质年,Smith第一次成功地将EcoRI核酸内切酶基因插入丝状噬菌体基因pⅢ中,并在噬菌体表面表达出了融合的蛋白。？噬菌体展示技术噬菌体展示技术的发展•1988噬菌质粒系统•1990抗体片段的展示•1993展示cDNA文库•1994研发了‘phagetwo-hybrid’技术•1996首次体内invivo淘选试验•1998噬菌体展示载体作为基因导入载体•1999Combinationofphagedisplaywithhigh-densityarrays•2001Automatedphagedisplayselection噬菌体展示技术的原理以噬菌体或噬菌粒为载体，将目标蛋白的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面，通过筛选表达有特异肽或蛋白质的噬菌体，并得到大量富集，从而获得目的多肽或蛋白质。噬菌体展示技术的优点•特定分子的基因型和其表型统一在同一个病毒颗粒内，将重组蛋白质筛选与基因筛选合二为一。•被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性，以利于靶分子的识别和结合。•由于丝状噬菌体易于在大肠杆菌系统中分离扩增，因此此技术又合并了选择能力和扩增能力的优势，使得噬菌体展示技术成为高效的筛选体系。•操作简单易行，该技术采用经典的PCR分子克隆等技术即可操作，在几周内即可筛选106～108克隆，筛选获得抗体库可以用于原核系统表达，无需组织培养，极大地降低了成本。•筛选获得噬菌体随机肽库具有容量大、体积小、筛选简便、制备成本低、可多次扩增等突出优点。噬菌体展示技术的局限性•所建库的容量和分子多样性受到限制；•不是所有的序列都能在噬菌体中获得很好的表达；•噬菌体展示文库一旦建成，很难再进行有效的体外突变和重组，进而限制了文库中分子遗传的多样性。•由于噬菌体展示系统依赖于细胞内基因的表达，所以，一些对细胞有毒性的分子如生物毒素分子，很难得到有效表达和展示。的基础上实现的。把用PCR法得到的抗体基因插入丝状噬菌体的DNA，在辅助噬菌体的帮助下，噬菌粒包装成丝状噬菌体，抗体分子通过与PⅢ或PⅧ相连，在噬菌体表面的一端或分散分布，然后可直接对噬菌体表面的抗体分子进行筛选。噬菌体抗体库的分类(1)根据免疫抗体库插入基因片段非免疫抗体库天然抗体库的来源半合成抗体库全合成抗体库第一个合成的噬菌体抗体库是Barbas等1992年报道将合成的一小段CDR3片段。CompanyLogo噬菌体抗体库的分类（2）按抗体基因的动物来源分类•鼠源性抗体库•人源性抗体库•驼源性抗体库CompanyLogo•从抗体库中可筛选多种重要的抗体，如膜蛋白抗原、自身抗原、病毒抗原的抗体。这些显示出抗体库技术的应用潜力。实例•Burmester等构建了青霉素免疫单链抗体库；•Yuan等从7个不同的人种,共47个健康人类的血液中提取基因,构建了人源天然单克隆抗体噬菌体抗体库第三章细菌的检测与治疗•噬菌体感染相应细菌后，迅速繁殖并产生子代噬菌体。利用该特性可将已知噬菌体加入被检材料中，如果噬菌体效价增强，就证明被检样品中有相应细菌存在。应用此原理可以对细菌进行检测。生物扩增法•原理：当样品中的待检细菌数目较少时，将不利于噬菌斑的形成，影响检测结果。如果加入能够被噬菌体裂解的辅助菌，被侵染的待检细菌裂解释放出来的子代噬菌体会立刻继续吸附裂解辅助菌，从而形成清晰的噬菌斑。因此根据噬菌斑的数目检测样品中病原菌的含量。将待检细菌的噬菌体与样品混合，37度培养1h，仅待检细菌被噬菌体吸附侵染加入灭病毒剂灭活5min，灭活所有未侵染宿主细胞的噬菌体；将辅助菌加入到样品中，中和灭病毒剂，并立刻混合后倒入琼脂平板进行培养释放出来的子代噬菌体裂解辅助菌；平板中形成清晰可见的噬菌斑。生物扩增法•该方法的关键是选择合适的灭病毒剂，其中化学试剂硫酸亚铁铵最为常用。利用该法已成功的检测出结核杆菌、沙门氏菌、李斯特菌、大肠杆菌、绿脓假单胞菌和弯曲杆菌等。荧光标记法•原理：荧光标记检测技术是指利用荧光染料制备荧光噬菌体，利用这种噬菌体的荧光特性来检测病原菌的方法。以食源性沙门氏菌的检测为例鸡蛋中检测到的沙门氏菌•方法荧光标记O-I噬菌体的制备与收集荧光标记的O-I噬菌体侵染宿主菌荧光显微镜观察结果O-I噬菌体液与1×SYBRR染料，按10∶1的比例混合,摇匀,在暗处作用10min0.2μm过滤收集荧光标记的噬体,1×PBS缓冲液冲洗2~3次除去标记噬菌体后多余的染料,最后去离子水洗涤滤膜回收噬菌体将待检样品于37℃静止培养6h预增菌后，加入荧光标记的O-I噬菌体暗处侵染20min，加入4%多聚甲醛终止反应，0.2μm滤膜过滤收集沙门氏菌阳性者均出现明显的杆状荧光，即带有荧光标记的沙门氏菌。检测结果•荧光标记噬菌体O-I对食品样品检测结果沙门氏菌O-I噬菌体与生物传感器联用检测方法•原理：根据具有专一裂解特点的烈性噬菌体能够将特异性的细菌裂解释放出胞内物质（如酶），通过生物传感器监控细菌胞内某种物质的信号变化，即可检测出致病菌。•利用这种方法可以在6～8h内检测出1CFU/100mL的大肠杆菌。•与生物传感器联用的噬菌体检测技术操作简单、分析速度快，但由于生物传感器抗干扰能力差、可靠性低，生物传感器在病原体检测中的应用受到一定的限制。应用报告噬菌体法检测致病菌•原理：应用DNA重组技术将报告基因首先插入到噬菌体DNA上，将带有报告基因的噬菌体与待检样品作用，随着报告基因在宿主菌中的表达，目标菌体便可快速得到检测。常用的报告基因有：绿色荧光蛋白基因(gfp)2细菌荧光素酶基因(lux)1β-半乳糖苷酶基因(lacZ)3带有荧光素酶基因(lux)的噬菌体在体外不发光，但当该噬菌体吸附侵染宿主细菌后，发光基因得以表达，因此，噬菌体在宿主细胞体内可以发光。含有gfp基因的噬菌体侵染特定的宿主菌后，该基因在宿主菌中表达并产生绿色荧光蛋白，再用荧光显微镜观察即可检测待检样品中有待检菌。检测实例••E.coli用以上三种基因均可进行检测噬菌体治疗•噬菌体对一些细菌具有高度的专一性,当噬菌体侵染