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植物原生质体培养技术原生质体（Protoplast）含义：去掉细胞壁的由质膜包裹、具有生活力的裸露细胞。植物原生质体培养的意义在真核生物中将遗传物质由一个个体传给另一个个体的传统方法是有性杂交。但是有时候会存在有性不亲和。如果通过细胞融合的手段就可以为远缘杂交提供一种可能性。高等植物原生质体除了可用于细胞融合的研究外，还能通过它们裸露的质膜摄入外源DNA、细胞器、细菌或病毒颗粒。原生质体的这些特性与植物细胞的全能性结合在一起，已经在遗传工程和体细胞遗传学中开辟了一个理论和应用研究的崭新领域。一原生质体的分离1材料来源植物原生质体最方便的来源是叶片，因为叶片中可以分离出大量的比较均一的细胞，而又不致使植物遭到致命的破坏。由于叶肉细胞排列疏松，酶的作用很容易达到细胞壁。植株的年龄和生长条件是十分重要的。来源：①无菌苗②温室培养的苗培养条件：低光照强度（1000lx）短日照温度为20～25℃相对湿度为60%～80%以及充足的氮肥供应。2前处理要保证酶解能充分的进行，必须促使酶溶液渗入到叶片细胞间隙中。为此，要做到：撕去叶片的下表皮，以无表皮的一面向下，使叶片漂浮在酶液中。或把叶片切成小块，结合真空处理效果更好。或用金刚砂摩擦叶的下表皮。3提取方法①机械分离法（Machanicalisolation）②酶法分离（Enzymaticisolation）①机械法优点：（1）能排除酶的有害影响；缺点：（1）原生质体的产量低；（2）方法繁琐费力；（3）局限性大②酶解法•纤维素酶类（Cellulase）•果胶酶类（Pectolyase）•半纤维素酶类（Hemicellulase）•崩溃酶•蜗牛酶原生质体分离常用的商品酶酶来源生产厂家纤维素酶类onozukaR–10绿色木霉YakultHonshaCo.Ltd.,Tokyo,JapanCellulysin绿色木霉Calbiochem.,SanDiego,CA92037,USADriselaseIrpexlutensKayowaHakkoKogyoCo.,Tokyo,Japan果胶酶类MacerozymeR-10根霉YakyltHonshaCo.Ltd.,Tokyo,JapanPectinase黑曲霉SigmaChemicalCo.,St.Louit,MO63178,USAPectolyaseY-23黑曲霉SeishinPharm.Co.Ltd.,Tokyo,Japan半纤维素酶RhozymeHP-150黑曲酶RohmandHassCo.,Philadelphia,PA19105,USAHemicellulase黑曲霉SigmaChemicalCo.,St.Louis,MO63178,USA图示：原生质体分离过程（以叶片为例）过滤、离心加果胶酶和纤维素酶注意事项：⑴酶溶剂及其渗透压酶溶剂：原生质体培养基或特殊配制。渗透压调节剂：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等浓度范围450～800mmol/L⑵酶处理：酶浓度酶解时间酶解温度二原生质体的纯化材料在酶液中一段时间后，轻轻振动容器或挤压叶片，使原来组织中的原生质体释放出来。此时还有一些亚细胞碎屑，尤其是叶绿体、维管成分、未被消化的细胞和碎裂的原生质体，因此必须除去。三种方法离心沉淀法漂浮法界面法①离心沉淀法•原理：原生质体的比重比较大，离心后原生质体沉于底部。•步骤：第一步原生质体溶液用400目网筛过滤。第二步离心（500～1000rpm,离心5～6min）。第三步吸去上清液，沉淀物重新悬浮，再离心沉淀。如此2～3次。第四步用原生质体培养液洗1次，收集原生质体。②漂浮法原理：利用比重大于原生质体的高渗蔗糖溶液，离心后使原生质体漂浮其上，残渣碎屑沉到管底。离心后碎屑沉到管底，一个纯净的原生质体带出现在蔗糖溶液和原生质体悬浮液培养基的界面上。③界面法500mmol/L蔗糖140mmol/L蔗糖+360mmol/L山梨醇原理：选两种不同渗透浓度的溶液，其中一种溶液密度大于原生质体的密度，另一种溶液小于原生质体的密度。100mmol/LCaCL2+300mmol/L山梨醇+原生质体三原生质体活力检测形态识别：形态上完整，呈圆形，含有饱满的细胞质，颜色鲜艳的即为存活的原生质体。三原生质体活力检测FDA法：FDA(二乙酸荧光素)是一种非极性物质，能自由地穿越细胞质膜，在活细胞内，FDA被酯酶裂解即发荧光（荧光素），由于荧光素不能自由通过质膜，因而可以在荧光显微镜下通过具荧光的细胞的观察确定细胞活性。伊凡蓝法：伊凡蓝不能穿过质膜，只有质膜受到严重损坏时，细胞才能被染色，因而可以通过细胞被染色与否确定活性。四原生质体培养1原生质体培养基无机盐：大量元素浓度；NO3－和NH4+的比例；Ca2+浓度有机成分：维生素、氨基酸、糖及糖醇等，酵母提取物、水解酪蛋白。激素：NAA、IAA、BA与2,4-D渗透压：甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等。原生质体的渗透压原则：培养基渗透压与细胞渗透压等渗2原生质体培养方法2原生质体培养方法液体浅层培养将含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一薄层，封口后进行培养。优点：操作简单，对原生质体的损伤小，且易于添加新鲜培养基和转移培养物。缺点：原生质体分布不均匀，常常发生原生质体之间的粘连现象而影响其进一步的生长和发育。此外，难以跟踪观察某一个细胞的发育情况。2原生质体培养方法液体－固体双层培养在培养皿的底部铺一层琼脂糖固体培养基，再将原生质体悬浮液滴于固体培养基表面。优点：固体培养基中的营养物质可缓慢释放到液体培养基中，如果在下层固体培养基中加一定量的活性炭，则还可以吸附培养物产生的一些有害物质，促进原生质体的分裂和细胞团的形成。缺点：不易观察细胞的发育过程。2原生质体培养方法固体平板培养即琼脂糖包埋培养。低融点的琼脂糖可在约30℃融化与原生质体混合而不影响原生质体的生命活动。混合后含有原生质体的培养基铺于培养皿底部，封口后进行培养。优点：可以跟踪观察单个原生质体的发育情况，易于统计原生质体分裂频率。缺点：操作要求严格，尤其是混合时的温度掌握必需合适，温度偏高则影响原生质体的活力，温度偏低则琼脂糖凝固太快原生质体不易混合均匀。2原生质体培养方法琼脂糖珠培养将含有原生质体的液态琼脂糖培养基用吸管以大约50ul一滴的量滴于直径6cm的培养皿，待其固化后向其中添加3ml液体培养基并于摇床上低速旋转培养。培养过程中，通过调整液体培养基的渗透压来调节培养物的渗透压以利于其进一步的生长和发育。这种方法由于改善了培养物的通气和营养环境，从而促进了原生质体的分裂和细胞团的形成。3原生质体发育和植株再生再生细胞壁细胞分裂与生长愈伤组织形成植株再生细胞壁的再生原生质体培养数小时后开始再生新的细胞壁，一至数天内便可形成完整的细胞壁。电镜观察发现，原生质体培养数小时后新壁开始形成，先是质膜合成形成细胞壁主要成分的微纤维，然后转移到质膜表面进行聚合作用产生多片层的结构，以后在质膜与片层之间或在膜上产生小纤维丝，逐渐形成不定向的纤维团，最后形成完整的细胞壁。细胞分裂和生长一般原生质体培养2～7d后开始第一次分裂，但开始第一次分裂的时间随植物的种类、分离原生质体的材料、原生质体的质量、培养基的成分和培养条件而异。一般用幼苗的下胚轴、子叶、幼根、悬浮培养细胞、未成熟种子子叶等为材料分离的原生质体，比用叶分离的原生质体容易诱导分裂，第一次分裂出现的时间较快。愈伤组织形成通常原生质体培养2周后，形成多细胞的细胞团，3周后形成肉眼可见的小细胞团，约6周后形成直径1mm的小愈伤组织。原生质体培养7～10d后需及时添加新鲜培养基，否则形成的细胞团不继续生长。待小愈伤组织长至约1mm时应及时转移到固体培养基上使其进一步生长。植株再生原生质体形成的愈伤组织直接转移到分化培养基上可一步成苗。但越来越多的试验证明，两步成苗法更适合大多数植物原生质体再生植株。即：首先将愈伤组织培养于含低浓度生长素培养基上，让其增殖和调整状态，再将其转移到分化培养基上分化成苗。Protoplastcultureandfertilegreenplantregenerationofrye.aFriableembryogeniccalli,bsuspensioncellaggregates,cfreshlyisolatedprotoplastsfromsuspensionculture,dprotoplastsstainedwithFDA,edivisionofcellderivedfromprotoplasts,fcellcoloniesderivedfromprotoplast,gproto-callidevelopedfromprotoplastsembeddedinagarose,hgreenshootformation,ifertilegreenplanta:firstdivision,10daysafterprotoplastisolationb,c:2and3womicrocolonies.d,e:4and6womicrocallif:8womicrocallijustbeforebeingtransferredontoB5mediumabcdefihgRecoveryofplantletsthroughsomaticembryogenesisg:TransferofmicrocalliontoB5mediumandinductionofsomaticembryos.h:TransferofglobularembryosontoB5mediumformaturationofsomaticembryos.i:TransferofcotyledonarystageembryosontoMSmediumforconversionofembryointoplantlets.OVER