第五章固定化酶及固定化技术

第五章固定化酶及固定化技术酶：在水溶液中－不稳定一次性使用-难回收，难连续化生产用于医药/化学分析－纯度要求高产物的分离纯化困难。。。。－－－要求将酶变成不溶性－－－实际上将酶限制在一定空间固定化固定酶具有催化活性1916年，美国科学家发现，酶和载体结合以后，在水中呈不溶解状态时，仍然具有生物催化活性。固定化酶可重复使用——操作稳定性酶在固定化后其活力可以缓慢释放,酶的稳定性比天然状态高,可重复多次使用.结果如图所示:固定化酶的活力基本保持稳定活力损失15%,由此可见该固定化酶具有良好的操作稳定性例:将0.5gDEAE纤维素固定化壳聚糖酶与10mL1%壳聚糖溶液在60℃下连续反应10次每次反应时间为6h每次反应后分别测定酶活力一、固定化酶（immobilizedenzyme）水溶性酶水不溶性载体固定化技术水不溶性酶（固定化酶）什么是固定化酶？固定化酶：是指经物理或化学方法处理，限制在一定的空间范围内，可以反复使用而又能发挥催化作用的酶制剂。酶的固定化技术包括吸附、交联、共价结合（化学偶联）及包埋等多种方法。与固定化酶技术相配套的是酶生物反应器同一般的化工容器一样，需要对酶反应器温度和pH等条件进行严格的控制；不同的是，酶反应器必须进行无菌操作。酶生物反应器简史1916年，Nelson&Griffin“酶不溶于水而具有活性”1948年，Sumner尿素酶制成非溶性酶1953年，Grubhofer&Schleith第一次实现了酶的固定化1960年，千细一郎，开始了氨基酰化酶固定化研究1969年，千细一郎成功的将固定化氨基酰化酶应用于DL-AA的光学分析上1971年，固定化酶名称提出，Immobilizedenzyme1973年，固定化微生物的应用——固定化大肠杆菌中的天冬氨酸酶，由反丁烯二酸连续生产L-天冬氨酸1976年，固定化酵母细胞生产啤酒和酒精1978年，日本用固定化细胞生产酶——固定化枯草杆菌生产淀粉酶1979年，固定化植物细胞和动物细胞开始研究1982年，日本首次研究用固定化原生质生产氨基酸1986年，郭勇等人固定化原生质研究二、固定化酶的优缺点：稳定性高；酶可反复使用；产物纯度高，极易将固定化酶与底物、产物分开；固定化酶的反应条件易于控制生产可连续化和自动化，节约劳动力；设备小型化、可节约能源。固定化酶同自由酶相比，具有以下优点：缺点：固定化所需载体和试剂较贵，成本高，投资大固定化时，酶活力有损失长期生产，易污染，载体易降解，酶易失活只能用于可溶性底物，较适用于小分子底物，对大分子底物不适宜与完整菌体相比不适宜于多酶反应，特别是需要辅助因子的反应三、固定化酶制备必须注意维持酶的催化活性及专一性。酶与载体的结合部位不应当是酶的活性部位（酶活性中心的氨基酸残基不发生变化）避免那些可能导致酶蛋白高级结构破坏的条件。由于酶蛋白的高级结构是凭借氢键、疏水键和离子键等弱键维持，所以固定化时要采取尽量温和的条件，尽可能保护好酶蛋白的活性基团。基本原则：固定化应该有利于生产自动化、连续化。载体能抗一定的机械力。固定化酶应有最小的空间位阻。酶与载体必须结合牢固，利于固定化酶的回收及反复使用。固定化酶应有最大的稳定性，所选载体不与废物、产物或反应液发生化学反应。固定化酶成本要低，以利于工业使用。酶的固定化方法四大类方法：吸附法（包括电吸附法）结合法（无机多孔材料）交联法（双功能试剂）包埋法（微胶囊法）——指通过氢键、疏水作用、电子亲和力等物理作用，将酶吸附到固体吸附剂表面的方法。优点：操作条件温和，固定化时酶分子的构象较少或者不变化；载体廉价易得缺点：结合力弱，易解吸附选择载体的原则（1）要有巨大的比表面积（2）要有活泼的表面（3）便于装柱进行连续反应。1.物理吸附法SMS:一种硅酸盐载体有机载体：纤维素、骨胶原、火棉胶无机载体：氧化铅、皂土、白土、高岭土、多孔玻璃、硅藻土、二氧化钛等2.结合法离子键结合法是指通过离子键将酶结合到具有离子交换基团的非水溶性载体上的方法。阴离子交换剂：DEAE-纤维素，DEAE-葡聚糖凝胶，AmberliteIRA-93，410，900；阳离子交换剂：CM-纤维素，AmberliteCG-50，IRC-50，IR-120，Dowex-50等。使用注意：pH、离子强度、温度离子结合法的操作简单，处理条件温和，酶的高级结构和活性中心的氨基酸残基不易被破坏，能得到酶活回收率较高的固定化酶。但是载体和酶的结合力比较弱，容易受缓冲液种类或pH的影响，在离子强度高的条件下进行反应时，酶往往会从载体上脱落。这是酶与载体以共价键结合的固定化方法，是载体结合法中报道最多的方法。归纳起来有二类：将载体有关基团活化，然后与酶有关基团发生偶联反应。在载体上接上一个双功能试剂，然后将酶偶联上去。(与交联法合用）共价结合法酶蛋白的侧链基团和载体表面上的功能基团之间形成共价键而固定的方法。可以形成共价键的基团：游离氨基，游离羧基，巯基，咪唑基，酚基，羟基，甲硫基，吲哚基，二硫键常用载体：天然高分子、人工合成的高聚物、无机载体首先载体上引进活泼基团然后活化该活泼基团最后此活泼基团再与酶分子上某一基团形成共价键关键共价键结合法制备固定化酶的“通式”载体活化—活化基团＋酶分子基团酶分子和载体连接的功能基团：酶蛋白N-端的α-氨基或赖氨酸残基的氨基酶蛋白C-端的羧基以及Asp残基的ß-和γ-羧基Cys残基的巯基Ser、Tyr、Thr残基的羟基Phe、Tyr残基的苯环His残基的咪唑基Trp残基的吲哚基A．重氮法B．叠氮法C．烷基化反应法D．硅烷化法E．溴化氰法载体活化的方法共价结合法与离子结合法或物理吸附法相比：优点：酶与载体结合牢固，一般不会因底物浓度高或存在盐类等原因而轻易脱落。缺点：该方法反应条件苛刻，操作复杂；由于采用了比较激烈的反应条件，会引起酶蛋白高级结构变化，因此往往不能得到比活高的固定化酶，酶活回收率一般为30％左右，甚至底物的专一性等酶的性质也会发生变化。只能用于酶，不能用于微生物的固定化3.交联法——是指通过双功能试剂，将酶和酶联结成网状结构的方法OH(CH2)3CHO+E-CH=N-E-N=CH(CH2)3CH=N-E-N=CH-NCH(CH2)3CHN-CH=N-E-N=CH(CH2)3CH=N-E-N=CH-交联法使用的交联剂是戊二醛、己二胺、双偶氮苯等水溶性化合物。戊二醛的两个醛基都可以与酶或者蛋白质的游离氨基酸反应，形成Schiff碱，从而使酶或者菌体蛋白交联，形成固定化酶或固定化菌体。例：采用天然高分子聚合物几丁质作载体，以戊二醛为交联剂，通过化学交联反应将纤维素酶固定在几丁质上，在戊二醛浓度1.25%，pH值4.0时固定纤维素酶，该固定化酶的半衰期为60天。用于降解壳聚糖，效果明显。交联法反应条件比较激烈，固定化的酶活回收率一般较低，但是尽可能降低交联剂浓度和缩短反应时间将有利于固定化酶比活的提高。单独使用交联法所得到的固定化酶颗粒小、机械性能差，酶活低，故常与其他方法联用酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联酶分子:（a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固定化酶（b）酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶4.包埋法是指将酶或含酶微生物包裹在多孔的载体中。网格型；微囊型。网格法——将酶分子或微生物包埋在凝胶格子里。天然凝胶：琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶等合成材料：聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光敏树脂等。网格型包埋法是固定化微生物中用得最多、最有效的方法。微囊型半透膜包埋法（微囊化法）：将酶包埋在有各种高分子聚合物制成的小囊中，制成固定化酶。半透膜：聚酰胺膜、火棉胶膜等微囊型固定化酶通常直径为几微米到几百微米的球状体，颗粒比网格型要小得多，比较有利于底物和产物扩散，但是反应条件要求高，制备成本也高。微囊发生器酶的固定化模式各类固定化方法的特点比较:比较项目吸附法结合法交联法包埋法物理吸附.共价键结合离子键结合制备难易易难易较难较难固定化程度弱强中等强强活力回收率较高低高中等高载体再生可能不可能可能不可能不可能费用低高低中等低底物专一性不变可变不变可变不变适用性酶源多较广广泛较广小分子底物、药用酶其他固定化酶方法结晶法：分散法：热处理法等等判断固定化方法的优劣及其固定化酶的实用性的指标有:(1)相对酶活力具有相同酶蛋白量的固定化酶与游离酶活力的比值通常高于75%(2)酶的活力回收率固定化酶的总活力与用于固定化的酶的活力之百分比称为酶的活力回收率。一般情况下,活力回收率应小于1,若大于1,可能由于固定化活细胞增殖或某些抑制因素排除的结果.(3)固定化酶的半衰期衡量操作稳定性的关键.固定化酶的过程中还存在几个亟待解决解决的难题：酶的活性中心发生物理化学变化导致酶活力降低酶固定化后多了空间屏障,增加了传质阻力酶和载体结合不牢固,容易脱落,酶活力损失大固定化颗粒成型困难固定化技术的改进定点固定化技术抗体偶联、生物素－亲和素亲和、氨基酸置换（Cys）多酶系统的共固定化多种酶同时固定在膜材料上,利用各自的功能协同催化复杂的生物转化过程新型的固定化技术高分子技术、纳米技术、光、辐射等作用加入表面活性剂可使酶活性大幅度提高，最高的达100倍，并增加了酶使用次数等等固定化对反应系统的影响不同制备方法，对酶反应系统产生的影响不同假定：酶固定化后，在载体表面或多孔介质中的分布完全均质整个系统各相同性四、固定化酶性质的变化：(一）影响固定化酶性能的因素固定化酶制备物的性质取决于所用的酶及载体材料的性质及相互作用。成分参数酶生物化学性质：分子量，辅基，蛋白质表面的功能基团，纯度（杂质的失活或保护作用）动力学参数：专一性，pH及温度曲线，活性及抑制性的动力学参数，对pH，温度，溶剂，去污剂及杂质的稳定性。载体化学特征：化学组成，功能基，膨胀行为，基质的可及体积，微孔大小及载体的化学稳定性机械性质：颗粒直径，单颗粒压缩行为，流动抗性（固定床反应器），沉降速率（流体床），对搅拌罐的磨损。固定化酶固定化方法：所结合的蛋白,活性酶的产量,内在的动力学参数质量转移效应:分配效应（催化剂颗粒内外不同的溶质浓度），外部或内部（微孔）扩散效应；这些给出了游离酶在合适反应条件下的效率。稳定性:操作稳定性(表示为工作条件下的活性降低)，贮藏稳定性效能:生产力（产品量/单位活性或酶量），酶的消耗（酶单位数/公斤产品）包括：酶本身的变化:主要由于活性中心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态等发生变化;载体的影响：在固定化酶的周围，形成了能对底物产生立体影响的扩散层以及静电的相互作用等引起的变化。载体与酶的相互作用：载体与酶的直接作用可能表现为活力丧失、破坏酶结构、封闭酶活性部位等。改变之一：构象改变、立体屏蔽构象改变：酶分子构象发生某种扭曲，导致酶与底物结合能力或催化能力下降立体屏蔽：固定化后，使得酶的活性中心或调节部位造成某种空间障碍，使得效应物或者底物与酶的临近或者接触受到干扰改变之二：分配效应、扩散限制微环境：微环境是指在固定化酶附近的局部环境，而把主体溶液称为宏观环境。分配效应：由于载体性质，造成底物和效应物等在微观体系和宏观体系之间的不等性分配，从而影响酶促反应速度扩散限制效应：底物、产物和效应物等，在环境中的迁移运转速度收到限制DEAE纤维素固定化壳聚糖酶:以DEAE纤维素为载体戊二醛为交联剂固定壳聚糖酶改变之三：微扰由于载体的亲水、疏水作用和介质的介电常数等性质,直接影响酶的催化能力或酶对效应物作出反应的能力1.固定化后酶活力的变化固定化酶的活力在多数情况下比天然酶小，其专一性也能发生改变。例如：用羧甲基纤维素载体固定的胰蛋白酶消化不同底物：酪蛋白（高分子）－－原酶活力的30%苯酞精氨酸-对硝基酰替苯胺(低分子)－原酶活力的80%。一般认为高分子底物受到空间位阻的影响比低分子底物大。