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1、基因工程至少需要哪三种工具？各自作用？2、DNA连接酶的种类和作用？温故知新：3、作用于磷酸二酯键和氢键的酶有哪些？4、基因工程的载体的来源？5、作为载体的必要条件有哪些？6、质粒的本质？1.2基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序主要包括哪几个步骤？1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定问题1一：目的基因的获取如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因，还有植物的抗病（抗病毒、抗细菌）基因、种子贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因、干扰素基因等。1.目的基因主要是指___________________编码蛋白质的基因什么是目的基因2、也可以是一些具有调控作用的因子获取目的基因的常用方法有哪些?1、从基因文库中获取目的基因2、利用PCR技术扩增目的基因3、人工合成目的基因已知序列未知序列(一)从基因文库中获取目的基因将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。1.基因文库概念2.基因文库类型基因组文库部分基因文库（包含一种生物的所有基因）（包含一种生物的一部分基因）基因组文库与部分基因文库的关系怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢?根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA、基因的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。4.cDNA文库的构建提取某种生物的某器官或特定发育时期的mRNA单链cDNA双链DNA片段重组载体与载体连接cDNA文库反（逆）转录酶DNA聚合酶导入受体菌中储存反转录法：以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。cDNA合成过程是：第一步，反转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA单链，形成RNA-DNA杂交分子。第二步，核酸酶H使RNA-DNA杂交分子中的RNA链降解，使之变成单链的DNA。第三步，以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。问题2为什么用生物发育某个时期的mRNA反转录得的DNA只有这种生物的部分基因？某个时期的发育是基因选择性表达的结果。两种基因文库的主要区别如下表（课本P10）文库类型cDNA文库基因组文库文库大小小大基因中启动子无有基因中内含子无有基因多少部分基因全部基因物种间的基因交流可以部分基因可以总结1、概念：PCR全称为________________，是一项在生物____复制_____________的核酸合成技术。3、条件：2、原理：__________多聚酶链式反应体外特定DNA片段DNA复制(二)利用PCR技术扩增目的基因模板（目的基因）原料(脱氧核苷酸)引物（一小段单链DNA）TaqDNA聚合酶温度控制4、操作前提：一段已知目的基因的核苷酸序列，以便合成引物。6、结果：。5、扩增形式：指数形式（2n，n为扩增循环的次数）在短时间内大量扩增目的基因7、过程：（见非第6页）a、变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，_____断裂，形成___________b、复性（退火）（55℃-60℃）：系统温度降低，引物与DNA模板链结合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在TaqDNA聚合酶的作用下，从引物开始进行碱基互补配对，合成与模板链互补的________。氢键单链DNA双链DNA链(二)利用PCR技术扩增目的基因动画演示（三）通过DNA合成仪直接合成目的基因（化学合成法）DNA合成仪推测推测化学合成前提：基因比较小、核苷酸序列已知蛋白质的氨基酸顺序mRNA核苷酸序列基因DNA的核苷酸序列目的基因另一种：反转录法（见非第6页）问题43、如果不知道目的基因的核苷酸序列，可采用_______________________获取目的基因的三种方法应用1、如果知道目的基因及两端的核苷酸序列，而且基因比较大，可采用____________2、如果知道目的基因的序列，而且基因比较小，可采用________________PCR技术扩增化学方法人工合成从基因文库中获取的方法二：基因表达载体的构建——基因工程的核心1目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。2组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因等启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片段，RNA聚合酶识别和结合的部位。终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片段，能终止mRNA的转录。标记基因：鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来。3.基因表达载体的构建过程质粒DNA分子限制酶处理两个切口获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种一个切口两个黏性末端基因表达载体应具备的条件（见非第7页）（1）对受体细胞无害（2）能够自我复制（3）具有标记基因，以便于鉴定目的基因是否进入受体细胞。（4）重组DNA分子大小应适合，以方便操作。跟踪训练：(2012年江苏无锡高二检测)如图为基因表达载体的模式图，下列有关基因工程中载体的说法错误的是()A．基因工程的核心步骤是基因表达载体构建B．任何基因表达载体的构建都是一样的，没有差别C．图中启动子位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位D．抗生素抗性基因的作用是作为标记基因，用于鉴别受体细胞中是否导入了目的基因B完