第四讲 G蛋白偶联受体研究进展课件

G蛋白偶联受体研究进展Gprotein-coupledreceptor,GPCRGPCRG蛋白偶联受体(Gprotein-coupledreceptor,GPCR),是人体内最大的蛋白质家族,迄今已报道了近2000种不同的GPCRs。GPCRs因能结合和调节G蛋白活性而得名。GPCRs的配体多种多样,包括生物胺、肽类、糖蛋白、脂类、核苷酸、离子和蛋白酶等。各种光、嗅、味的信号分子也由GPCRs介导。大多数GPCRs通过G蛋白调节细胞内信号传递,例如,刺激或抑制腺苷酸环化酶(AC)和活化磷脂酶的活性,调节钾及钙离子通道的活性。有些GPCRs通过酪氨酸激酶、Src、Stat3途经传递信息,与细胞增值、细胞转化有关。人类基因组测序表明,约有720个基因参与了GPCR的合成。GPCR功能失调会导致许多疾病的产生,如阿尔茨海默氏症(alzheimers)、帕金森症(Parkinsondisease)、侏儒症(midgetism)、色盲症(acritochronacy)以及哮喘(asthma)等。接近50%的药物是用GPCR作为它们的靶标。对于GPCR的研究具有极其重要的意义。GPCR的结构GPCR的肽链N末端,7个跨膜α螺旋(TM1→TM7)。C末端,3个胞外环(ECL1→ECL3)及3~4个胞内环(ICL1→ICL4)组成。N端在胞外,常常被糖基化。C端在胞内,多表现为磷酸化。7个跨膜的α螺旋反复穿过细胞膜的脂双层。不同GPCR跨膜螺旋区的氨基酸比较保守,而C/N末端和回环区的氨基酸差异较大。牛视紫红质结构的模式图胞外侧胞内侧ECLICLTM1TM7目前只有一种GPCR蛋白—牛视紫红质(bovinerhodopsin)的晶体三维结构被构建。细胞质的末端区域通常被疏水残基所环绕,它们一同形成了G蛋白的结合位点。牛视紫质受体在C末端有一段短的α螺旋,并与膜平行,称之为TM8,可能对于受体的结构稳定起着重要的作用。一些亚家族受体间存在着一些相似的结构,如几乎所有GPCR都具有二硫键等。GPCR分类A族，又称为视紫红质(rhodopsin)/β2肾上腺素受体族，分为6个亚族:①生物胺受体;②胆囊收缩肽、内皮素、速激肽、神经肽Y等;③非脊椎动物的视蛋白和缓激肽受体;④腺嘌呤、大麻类、黑皮素及嗅觉受体;⑤趋化因子、互补因子、促性腺激素释放激素(GnRH)等;⑥褪黑激素受体及其它。B族,又称为胰高血糖素/血管活性肠肽/降钙素受体样受体族,分为4个亚族:①降钙素和促肾上腺皮质激素释放因子受体;②甲状旁腺激素受体;③胰高血糖素、类胰高血糖素肽、垂体腺苷酸环化酶活化肽、血管活性肠肽和分泌素受体;④Latrotoxin受体。C族,又称为神经递质/钙受体样受体族,分为5个亚族:①谷氨酸受体;②γ-氨基丁酸(GABA)受体;③钙受体;④鼻神经外激素受体;⑤味觉受体。D族—真菌信息素(fungalpheromone)受体E族—cAMP受体(cAMPreceptor)在GPCR家族中,A族受体数目最多。A族受体共有二十多个高度保守位点。A族的12个高度保守位点功能见表。B族受体的N末端较长且较保守,主要结合一些大的配基,如胰高血糖素、分泌素等。C族受体的N未端(大约600个氨基酸)和C未端都很长,在C-Ⅰ与C-Ⅱ间也由两个Cys形成二硫键,C-Ⅲ环短并且高度保守。配体结合域A族受体的配体结合域一类是小分子配体,小分子配体结合在受体跨膜α螺旋形成的结合裂隙中。经典的小分子配体有肾上腺素(E)、去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5-羟色胺(5-HT)、组胺(His)、乙酰胆碱(Ach)、前列腺素(PGs)、白三烯(LTs)和嘌呤(purine)等。另一类是大分子肽类配体,肽类配体主要结合在受体的胞外结构域。P物质、神经激肽A、神经激肽B、血管紧张素、神经肽Y、白介素8,抗利尿激素等肽类配体。B族受体的配体结合域与A族的肽类配体类似,B族受体的肽类配体结合部位主要位于受体的胞外结构域。B族受体的N末端在大多数配体与受体的结合中起关键作用。例如分泌素、血管肠肽、胰高血糖素等肽类配体,它们不仅与受体的N末端结合,而且与受体的ECL相互作用。C族受体的配体结合域C族受体的配体主要有谷氨酸、GABA和Ca2+。这些配体虽然分子小,但是其与A族小分子配体在受体上的结合部位不同,均位于受体胞外的N末端。GPCRs活化的分子机制1.分子内相互作用力使GPCRs处于静止构象在没有激动剂时,分子内相互作用力使GPCRs处于静止(非活性)构象,当受体与激动剂结合或受体发生突变时,破坏了受体分子内相互作用力,使受体的关键序列暴露给G蛋白,从而活化G蛋白。可以认为,分子内相互作用力遭到破坏是GPCRs活化机制之一。使受体易于在活性构象和非活性构象之间转变。2.质子化是GPCRs活化的关键A族受体ICL2上有一保守的DRY(Glu/Asp-Arg-Tyr)基序,许多实验证明,当受体活化时,其Glu/Asp发生质子化。3.GPCRs活化中的构象变化GPCRs活化中的构象变化,研究的最多的是视紫红质。多种光谱技术的研究结果表明,在视紫红质活化为变视紫红质Ⅱ的过程中,发生了构象重排。4.GPCR与G蛋白偶联信号从活化受体传递给G蛋白的机理还不清楚。实验证实,GPCRs的ICL2和ICL3在与G蛋白偶联中发挥重要作用。其中ICL3决定偶联G蛋白α亚基的特异性,ICL2决定G蛋白的活化。5.受体二聚化研究表明,许多GPCRs,包括视紫红质、分泌素、谷氨酸受体等能形成二聚体。激动剂有时能提高受体二聚体的水平,有时却降低或不改变受体二聚体的水平。受体二聚化的作用还不清楚,可能与受体个体发育和受体功能的多样性有关。①GPCRs双聚化的结构基础尽管GPCRs在分子结构上都有七个跨膜区,但不同的GPCRs在细胞膜内外的结构却有较大的差别,因此分子内部发生双聚化的区域、方式也不尽相同。有的GPCRs双聚化依靠二硫键,还原剂可以减弱或消除双聚体形成;另一些则可能通过分子间的疏水键相互作用形成双聚体,可被SDS(二烷基硫酸钠)解聚。GPCRs的双聚化可发生在胞外的N端、跨膜区、胞内环、胞外环以及胞内的C末端。例如mGluR5含19个Cys的胞外N端,其中9个在近膜区,其双聚化可以被还原剂DTT完全消除,表明二硫键在形成双聚化中起关键作用,用胰蛋白酶水解除去受体胞外N端后,则不再发生双聚化,这表明mGluR5双聚化在胞外N端。类似的受体还有GluRlα和CaR。阿片受体有彼此同源性较高的DOR、κ受体(KOR)、μ受体(MOR)三种亚型。②GPCRs双聚化对细胞信号转导的影响GABABR属于GPCRs。GABABR又包括GBR1和GBR2两种亚型。GBR1＋GBR2→表达→功能受体间相互作用可促进受体蛋白合成后的转运和定位,也解释了体外单独表达的GBR1不具有天然组织受体功能的分子机制。在功能方面,单独表达两受体,激动剂引起的AC抑制、35s-GTP-s结合、GIRK的激活等几乎不能发生,而共表达后上述功能明显增强。用免疫共沉淀法发现两受体可通过C末端形成双聚体.可见,GBR1在膜上的定位及发挥功能依赖于和GBR2形成双聚体。受体的双聚化有病理和药理学方面的意义抗CCR5N端的抗体在体外培养细胞和小鼠体内显示出较强的抑制HIV-1复制的作用,而抗体与激动剂均可诱导CCR5双聚体的形成,而针对受体其它部位的抗体不能导致受体双聚化,也不能抑制HIV-1的感染。因此提示,诱导CCR5的双聚化可以阻断HIV-1通过CCR5引起的感染。6.GPCRs的失敏及内吞作用绝大多数与G蛋白相偶联的受体在激动剂的长期或反复刺激下都会出现反应性降低的现象称为失敏(desensitization)。受体失敏作用随着激动剂作用时间的延长会经历不同的变化过程。在激动剂刺激后几秒至几小时内,受体对刺激的反应性降低,但细胞膜表面的受体数量并未减少;如果这种作用持续存在,会引起膜表面受体数量降低,即发生内吞(internalization);甚至进一步发生不可逆的降解,从而引起受体下调(down-regulation).大多数的GPCRs激活后,在第二信使激酶或G蛋白偶联受体激酶的作用下发生快速磷酸化;受体的磷酸化提高了其对arrestin(阻碍蛋白)的亲和力,两者形成复合体并促使受体与G蛋白解偶联;进而此复合体与笼形蛋白衣被小泡结合并在dynamin(发动蛋白)的调解作用下发生内吞,并隐没(sequestration)于胞内。内吞后的受体可能发生两种变化:一是在衣被小泡内发生去磷酸化,通过再循环回到胞膜表面,完成复敏(resensitization);二是受体被降解,发生下调。但是有些受体在此过程中并不需要arrestin和dynamin的介导,如血管紧张素Ⅱ(ATⅡ)受体。GPCRs＋GPinternalizationdown-regulationarrestinGPCRs＋arrestinGPresensitizationdynaminenzyme①与受体磷酸化相关的激酶GPCRs被配体激活后,在激发下游信号转导通路的同时,GPCRs本身也会发生快速的磷酸化,作用于受体的蛋白激酶家族已知有两种:第二信使激酶：包括cAMP依赖的蛋白激酶(PKA)、蛋白激酶C(PKC)等,其中PKA主要作用于Gs偶联受体,而PKC则作用于Gq偶联受体;GPCRs激酶(Gprotein-coupledreceptorkinases,GRKs)：主要作用于经典的信号反馈调节通路,介导第二信使系统间的相互对话。GRKs有六种:视紫红质激酶(GRK2)、肾上腺素受体激酶(βGRKs)的两种异型体(GRK1和GRK3)、遗传性慢性舞蹈病患者4号染色体中克隆出的IT11(GRK4、GRK5)以及一些从果蝇中克隆的多种同源物.②受体磷酸化激酶的作用机制视紫红质激酶和β-肾上腺素受体激酶存在于胞质中,但它们的作用底物却在胞膜上,因此,他们发挥作用时必须由胞质向胞膜发生移位(translocation)。视紫红质激酶发生移位的主要机制：其C末端的Cys发生异戊二烯化(isoprenylation),使得C末端水解,最终导致激酶由胞质向胞膜移位。如将C末端的Cys点突变为Ser,异戊二烯化被阻断,视紫红质激酶的作用随之降低。β-肾上腺素受体激酶的移位机制：激酶本身并不发生异戊二烯化,而是与受体相偶联的G蛋白发生异戊二烯化。受体被激活后,G蛋白的β、γ亚基可激活β-肾上腺素受体激酶,同时γ亚基也发生异戊二烯化,进而对激酶接近胞膜上的受体起易化作用。③arrestin蛋白、笼形蛋白与笼形蛋白衣被Arrestin最重要的作用是促使激活的、磷酸化的受体与G蛋白解偶联,加速受体的失敏。内吞的可能机制衣被复合体主要有三类:衣被蛋白I(Coatprotein-I,cop-Ⅰ)、衣被蛋白Ⅱ(Coatprotem-Ⅱ-,copⅡ)和笼形蛋白(clathrin)。衣被蛋Ⅰ和衣被蛋白Ⅱ主要参与小泡在高尔基复合体和内质网之间的转运;笼形蛋白则主要参与液相物质和受体由胞膜以及反向高尔基网(transGolginet-work,TGN)向内涵体(endosome)的转运。内吞后的受体隐没于内涵体。内涵体中的磷酸酶在酸性条件下可以特异地引起磷酸化的受体去磷酸化,进而使得受体复敏并再循环至胞膜重新发挥作用。这一过程与受体的失敏和内吞一样,G蛋白受体激酶,arrestin和笼型衣被小泡起到至关重要的作用。GPCRs的活化模式1.二态模式受体处在非活性构象(R)与活性构象(R*)的平衡之中,即R↔R*。•在没有激动剂的情况下,R占绝大多数,R和R*之间的能障很低,使一部分R自发地变成R*。•激动剂与R*有很强的亲和力,使平衡发生移动,增加R*的比例。•拮抗剂能稳定R,使平衡从R*移向R。