4植物脱毒技术

细胞工程第4章植物脱毒与离体无性繁殖技术一.病毒在植物体内的分布及危害；二.植物脱毒的意义三.植物脱毒的原理和方法；四.植物脱毒苗的鉴定；五.植物脱毒苗保存、应用与繁殖教学内容目的与要求：了解：1、病毒在植物体内的分布及危害。理解：1、脱毒苗的意义；2、植物脱毒苗的鉴定、保存、应用与繁殖。掌握：1、无病毒苗概念；2、植物脱毒的原理和方法。。由于危害可通过营养体传给后代，病毒对寄主植物可造成毁灭性危害，导致大幅度减产，甚至全株死亡。世界作物生产中，病毒危害程度仅次于真菌。甘蔗黑穗病2006年，这一疾病能使作物的生长速度与收成降低百分之三十，从而使澳大利亚昆州总值十五亿澳元的蔗糖产业受到灾难性威胁。有关方面还发现这一疾病已经传染至该农场中的许多其它作物。感染黑穗病的作物呈现弯曲状，从作物顶部朝下呈灰至黑色。甘薯种性退化甘薯良种随着种植年代的增加会出现植株变小、分枝减少、叶片皱缩、羽状斑纹、生长势衰退、块茎变小、产量品质明显下降、甚至丧失生产利用价值，这种现象就叫做年甘薯种性退化。甘薯种性退化是长期以来普遍存在严重影响甘薯生产发展的一个重大问题，一般减产高大30%以上。甘薯种性退化研究证明，甘薯种性退化原因主要是由病毒侵染造成的。目前世界上已报导侵染甘薯的病毒有十多种，在我国主要有两种：一是甘薯羽状斑驳病毒，主要症状是叶片出现规则退绿条纹或带有紫色边缘的退绿斑，也可沿叶脉行成紫色羽状斑纹，植株生长势减弱，薯块上产生褐色纵裂，薯块内部形成褐色的内木栓，薯块变小，产量品质下降；二是甘薯潜隐病毒，其症状表现不明显，产量品质下降。马铃薯病毒病马铃薯新品种推广后，随着种植年限的增加，产量逐年下降，植株变矮，薯快变小，并伴有茎叶异常现象，如花叶、叶片卷曲或皱缩等。这种现象称之为退化。引起马铃薯退化的主要原因就是病毒病。花卉一般来说，病毒侵染花卉后，使花卉表现褪色、组织坏死和畸形等症状。但是，有些情况，使花卉的叶和花发生变异而更具有观赏价值。菊花中的“绿牡丹”,由于受病毒和类菌原体的侵染，使菊花花冠卷曲，花朵呈绿色，而且通过无性繁殖，可以保存下来。“矮化因子”实际是一种侵染植物的病毒，它引起一些木本植物的矮化，可以将它们利用到果树栽培和盆景制作中去。危害一些植物的病毒数目植物种类感染病毒种类植物种类感染病毒种类植物种类感染病毒种类菊花19矮牵牛5苹果36康乃馨11百合6柑橘23水仙4马铃薯17葡萄26唐菖蒲5大蒜24草莓24风信子3豌豆15桃23月季10樱桃44梨11病毒对寄主植物可造成毁灭性危害，导致大幅度减产，甚至全株死亡。潜隐性病毒侵染植物造成症状不明显的慢性危害，不易被发现，尤其危险。国内外解决作物病虫害的有效途径是培育无病毒苗，实施农作物无病毒化栽培。无病毒苗，脱毒苗是指不含该种植物的主要危害病毒，即经检测主要病毒在植物内的存在表现阴性反应的苗木。脱毒后的马铃薯苗应用植物脱毒技术意义植物脱毒技术可使植物恢复原来优良特性，生长势增强，明显提高产量、改善品质，产量的提高幅度最高可达300%。植物脱毒技术不仅脱除了病毒，还可以去除多种真菌、细菌及线虫病害，使种性得以恢复，植株生长健壮，减少肥料和农药施用量，降低生产成本，保护了环境一.病毒在植物体内的危害及分布1.危害:绝大多数植物都可以无性繁殖的,容易受到多种病原菌的侵染,体内积累浓度相当高的病毒。在无性繁殖的种类中，由于病毒通过营养体进行传递，在母株内逐代积累，危害日趋严重。病原菌的侵染不一定会造成植物的死亡,却会大大降低植物的生长发育及产量和质量,从而影响其栽培的经济效益。因此,脱除病毒及其他病原菌对植物栽培生产是非常必要的。一.病毒在植物体内的危害及分布2.分布在植物体内的分布具有不均匀性，随植株不同部位和年龄而异。老叶和成熟组织及器官中病毒含量较高根尖、茎尖生长点约0.1~1mm区域内，几乎不含病毒。（原因？）(原因：分生组织细胞分裂和生长速度快，而病毒在植物体细胞内繁殖速度相对较慢；另外，病毒是通过筛管组织或胞间联丝传播至其他组织细胞的，而茎尖分生组织无分化，没有维管组织。)二、植物脱毒的意义任何一种优良品种均需有一个稳定地保存其遗传性状的繁殖方法。离体无性繁殖可以很好地保持品种的优良特性，是无性繁殖品种繁育的理想途径。1、能够有效地保持优良品种的特性2、快速繁殖品种，使优良品种迅速应用◆离体繁殖周期短◆不受季节限制◆繁殖系数高◆繁殖速度是任何其他方法所不能比的又称之为快繁3、生产无病毒种苗，防止品种退化受病毒危害严重的作物：大田作物：马铃薯、甘薯、甘蔗、烟草蔬菜：白菜、大蒜、葱、番茄、箩卜果树：柑橘、苹果、草莓、香蕉花卉：香石竹、各种菊花、天竺葵、紫罗兰4、节约耕地，提高农产品的商品率块根、块茎、鳞茎为繁殖器官的作物，每年产品用留作种的比例：◆大蒜：留种量占产量的五到八分之一◆马铃薯：留种量占产量的十分之一◆贝母：留种量占产量的三分之一(贝母：多年生草本植物,其鳞茎供药用,有止咳化痰、清热散结之功。产于四川、云南、陕西秦巴山区，甘肃等地)5、便于运输常规的块根、块茎等，体细胞大、含水量高，包装、运输十分不便。离体繁殖的种苗体积小，易携带，运输十分方便。马铃薯是一种全球性的重要经济作物。适应性广，营养价值高，耐贮藏适运输，既是一种重要的粮食作物也是一种调节市场供应的重要蔬菜。马铃薯原产于拉丁美洲，当被发现可以食用后，很快传到世界各地，成为栽培很广的一种作物。危害有17种之多，如X病毒、S病毒、Y病毒、M病毒、A病毒、花叶病毒、纺锤形块茎病毒等。马铃薯病毒可使块茎产量减少50%~80%。马铃薯病毒的种类1、形态特性(1)根根系由出生根和匍匐根组成。(2)茎分地上部分和地下部分。(3)叶全缘，心脏形。(4)花为聚伞花序。(5)果实浆果。（一）、马铃薯特性和生物学习性马铃薯性喜冷气候，不耐高温和霜冻。发芽适温为12~18℃。地上茎叶生长温度为17~21℃。块茎形成要求昼温14~24℃，夜温12~14℃。结薯期要求12h左右的短日照和疏松、湿润、肥沃以及通气良好的土壤条件。土壤板结，薯块表面粗糙和薯形不整。2、生物学习性全国现有马铃薯播种面积300多万公顷，每年需合格种薯45亿公斤，脱毒原种4亿公斤，脱毒小薯或微型薯45亿粒。我国的马铃薯平均单产仅为13.60吨/公顷，是世界单产最高国这瑞士（48.80吨/公顷）的1/4。最主要的因素就是种薯质量差，品种布局不合理。我国马铃薯栽培现状以马铃薯为例：按一亩地4000株计算，常规薯4000个重200kg（每个50g），若用试管薯4000个则只有2kg（每个0.5g）。马铃薯试管薯(Microtuber)是指在培养瓶内通过诱导，于试管苗叶腋问形成的直径为2—10毫米大小的块茎。试管薯不仅具有试管苗的所有优点，而且由于体积小、重量轻，繁殖期间杜绝了外来病菌的再次侵染，贮藏、运输、种植方便。马铃薯试管薯的诱导与生产，对于马铃薯种质保存、种子交换、脱毒苗繁殖等方面都有重要意义。三、植物脱毒的原理和方法（一）植物脱毒原理：1）植物病毒本身不具有主动转移的能力。在一个植物体内，病毒易于通过维管系统而移动，但在分生组织中不存在维管系统。病毒在细胞间移动只能通过胞间连丝，速度很慢，难赶上活跃生长的茎尖；2）在旺盛分裂的分生细胞中，代谢活性高，竞争抑制了病毒的复制；3）在植物体内，可能存在着病毒钝化系统，它在分生组织中比其他任何区域具有更高的活性。4）在茎尖存在高水平内源生长素，也可能抑制病毒的增殖。（二）植物脱病毒方法物理方法化学方法生物方法高温处理茎尖培养微体嫁接珠心培养愈伤脱毒热处理脱毒1.热处理脱毒法热处理脱毒原理病毒DNA分子进入细胞后随植物细胞DNA一起复制。热处理并不能杀死病毒，只能钝化病毒活性，使病毒在植物体内增殖减缓或增殖停止，失去传染能力。作为一种物理效应可以加速植物细胞的分裂，使植物细胞在与病毒繁殖的竞争中取胜。热处理方法（1）愈伤组织热处理离体培养愈伤组织热处理继代分化培养。常用温度及时间：低温37—38℃处理2周、4周或8周；高温50℃处理3—5min。（2）热空气处理脱毒法试验母株在高温生长室中生长一段时间，其顶端分生组织比次生分生组织生长迅速，后切取其茎尖分生组织进行离体培养。生长室温度35-40℃光照3000—10000lx热处理的优缺点优点:方法简单，效果明显。缺点:1)具有局限性，不能去除所有病毒。只对圆形病毒（苹果花叶病毒），或对线状病毒（马铃薯卷叶病毒）有效；而对杆状病毒（千日红病毒）无效。2)热处理后只有小部分植株能够存活。极易使植物材料受热枯死，造成损失3）延长热处理时间，病毒钝化效果好，同时也可能会钝化植物组织中的抗性因子而降低处理效果。其它效果•香石竹（康乃馨）在38℃～40℃下经两个月处理可除去全部病毒。马铃薯在37℃下处理10～20天能除去卷叶病毒。2.组织培养脱毒法包括微茎尖培养脱毒、愈伤组织培养脱毒、珠心组织培养脱毒。（1）微茎尖培养脱毒法脱毒效果好后代遗传稳定使用最广泛的一种方法1）原理及依据病毒在植物体内分布不均，茎尖处含量最少病毒DNA分子与细胞分裂蛋白质合成竞争2）操作程序外植体经表面消毒灭菌后，在解剖镜下，经无菌操作切取小茎尖，接种到备用培养基上，放入培养室内进行培养，并及时观察和记录培养结果。茎尖培养1）茎尖大小：一般以带1-2片叶原基为好，大小为0.2-0.3毫米为宜，超过0.5毫米时，脱毒效果差。（外植体过小茎尖存活率低）2）培养基：能使茎尖快速生长、分化的培养基均适于脱毒。3）前处理：切取茎尖之前，植物材料如经过预处理，如热水或热空气处理、低温处理、药物处理，均可大大提高脱毒效率。4）培养条件：同一般茎尖培养5）外植体生理状态：由活跃生长的芽上切取茎尖脱毒方法1、取样与消毒可直接选定的植株上取顶芽进行消毒接种。采顶芽与侧芽消毒接种。消毒方法是：剪取顶芽梢段3、5厘米，剥去大叶片，用自来水冲洗干净，在75%酒精中浸泡30秒左右，用1%-3次氯酸钠或5%-7%的漂白粉溶液消毒10-20分，最后用无菌水冲洗材料4-5次。酒精擦拭旋转灼烧显微镜下获取茎尖接种盖好瓶塞优缺点：茎尖越小，去病毒机会越大，脱毒效果就越好，但同时因为其含营养及水量太低，故培养时对培养基的要求就越高，对剥离技术要求也越高。脱毒马铃薯试管苗2、愈伤组织培养脱毒法（1）原理及依据a、病毒在植物体内分布不均匀b、病毒复制的能力衰退或丢失c、继代培养的愈伤组织产生抗性变异（2）技术关键诱导再生植株的愈伤组织（3）操作程序植物各种器官或组织诱导产生出愈伤组织，愈伤组织多次继代，然后从愈伤组织再诱导分化芽，长成植株。愈伤组织培养脱毒法脱毒效果不定，常出现一些变异。（3）珠心组织培养脱毒法病毒是通过维管组织传播，而珠心组织和维管束系统无直接联系，故可以通过珠心组织离体培养获得无病毒植株。目前已用该方法去除了柑橘银屑病、叶脉突出病、柑橘裂皮病、速衰病等病毒。缺点：会有20%~30%左右的变异率，同时无毒苗苗期较长。柑橘要6~8年才能结果。3.微体嫁接离体培养脱毒法应用微体嫁接的原因：木本植物茎尖培养难以生根形成植株。具体做法：将极小的茎尖（0.14mm~1.0mm）作为接穗嫁接到不带病毒的种子实生苗砧木上，然后将砧木、接穗一起在培养基上培养。优点：接穗在砧木上易成活，故可用很小的茎尖来培养，去除病毒几率大，获得无病毒苗的可能性大。微嫁接要求的剥离技术高，嫁接成活率与接穗大小呈正相关，而脱毒率与接穗大小呈负相关微体嫁接法(micrografting)脱除病毒的关键：①要求剥离技术很高②需要考虑砧木和接穗对营养组成的不同要求；③与接穗的取材季节有密切关系（苹果4~6月取材嫁接成活率较高。）四、植物脱毒苗的鉴定1、视觉观察法(直接检测法)看植株的茎叶是否有该病毒所有可见症状。番茄无菌小苗厚叶莲花掌植物病毒的症状植物病毒引起植株的症状是各异的，在观赏植物上由病毒引起外部症状主要有以下几种：（1）变色：褪绿、黄化、花叶、斑驳、红叶等，常见病毒有；香石竹斑驳病毒、黄瓜花叶病毒、芋花叶