朱曦

用基因工程技术在哺乳动物细胞表达一段特定核苷酸序列by朱曦By预防医学1403朱曦基因工程基因工程[1]（geneticengineering）又称基因拼接技术和DNA重组技术。所谓基因工程是在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。基因工程最突出的优点是打破了常规育种难以突破的物种之问的界限，可以使原核生物与真核生物之间、动物与植物之间，甚至人与其他生物之间的遗传信息进行重组和转移。人的基因可以转移到大肠杆菌中表达，细菌的基因可以转移到植物中表达。基因工程应用：1.运用基因工程技术，不但可以培养优质、高产、抗性好的农作物及畜、禽新品种，还可以培养出具有特殊用途的动、植物。2.基因工程做成的DNA探针能够十分灵敏地检测环境中的病毒、细菌等污染。（环境保护）3.许多药品的生产是从生物组织中提取的。受材料来源限制产量有限，其价格往往十分昂贵。微生物生长迅速，容易控制，适于大规模工业化生产。若将生物合成相应药物成分的基因导入微生物细胞内，让它们产生相应的药物，不但能解决产量问题，还能大大降低生产成本。如：胰岛素的大规模工业化生产。设计实验内容已知目的基因的cDNA序列(GenBank登录号:AK135903.1)，拟采用基因工程技术在哺乳动物细胞中表达该序列中的133-1941位核苷酸序列，请设计实验方案。基因工程基本流程目的基因的获取基因表达载体的构建将重组DNA导入受体细胞转染细胞的筛选得到产物一、目的基因获取目的基因：目的基因的cDNA序列(GenBank登录号:AK135903.1)中的133-1941位核苷酸序列Step1：在GenBank中查找此基因序列登陆：利用PCR技术扩增目的基因用PCR技术可以在体外有效而且特异的扩增目的基因DNA片段。主要原料：模板DNA（从cDNA文库中获得）TaqDNA聚合酶（耐高温）引物（提前设计并合成与目的DNA两侧互补的引物，琼脂糖凝胶电泳，分离和纯化PCR产物）设计引物PrimerPremier二、目的基因表达载体的构建基因表达载体的构建（即目的基因与运载体结合）是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。其目的是，将目的基因与运载体结合的过程，实际上是不同来源的DNA重新组合的过程。真核表达载体1.分子质量较小，能在细菌内稳定存在，有较高的拷贝数2.具有一个以上的遗传标记，便于对宿主的选择3.具有多个限制性核酸内切酶的单一切点，便于外源基因插入。*真核表达元件:，启动子、增强子、克隆位点、转录终止子信号和poly(A)加尾信号（保证新转录的mRNA能够有效地加上poly(A)）。Step1：载体的选择与准备选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。无论选用哪种载体，首先都要获得载体分子，然后采用适当的限制酶将载体DNA进行切割，获得分子，然后用碱性磷酸酶处理，去掉5’端磷酸根，以便于与目的基因片段进行连接。由于本次试验目的基因片段较小，仅在1-2kb之间，在经过查阅教材及网络后选择pBR322作为载体。pBR322质粒载体pBR322是研究得最多，使用最早且应用最广泛的大肠杆菌质粒载体之一。符号质粒载体pBR322中的“p代表质粒；“BR”代表两位两位研究者Bolivar和Rogigerus姓氏的字首，“322”是实验编号。质粒载体pBR322的大小为4361bp，相对分子质量较小的是它第一个优点。优点之二是它带有一个复制起始位点，保证了该质粒只在大肠杆菌的细胞中行使复制的功能。具有两种抗生素抗性基因——氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因，可供转化子的选择标记是它的第三个优点。Step2：DNA的体外连接不同来源的DNA片段通过限制性核酸内切酶切断或机械力剪断后，可以在体外重新连起来，形成人工重组体。主要以下四种方法：1.粘性末端（本次试验运用的方法）2.人工接头的使用2.加入同聚物尾4.平端连接基因表达载体的构建流程：载体构建的流程获得人工质粒载体分子(pBR322)用限制性核酸内切酶（BamHI：GGATCC）切割目的基因DNA片段与运载体碱性磷酸酶处理载体（去掉线性DNA分子5‘端磷酸根，防止质粒自身环化，便于与目的基因片段连接）用DNA连接酶连接运载体和目的基因三、将重组DNA导入受体细胞共有转化、感染、转染三种方法。鉴于其要求在哺乳动物表达，则选择转染。转染：由转化和感染两个词构成的新词，指真核细胞主动摄取或被导入外源DNA片段从而获得新的表型的过程。常用方法有电穿孔法、磷酸钙共沉淀法、脂质体融合法，DEAE-葡聚糖法（本次试验运用的方法）。常用的哺乳动物宿主细胞：中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、小仓鼠肾(BHK)细胞、COS细胞、小鼠NSO胸腺瘤细胞和小鼠骨髓瘤SP2/0细胞等DEAE-葡聚糖法外源DNA或重组质粒DNA与DEAE葡聚糖混合，DEAE葡聚糖有带大量正电荷的化学基团，可与DNA中带负点荷的磷酸基团结合，并黏附于细胞表面，借助细胞内吞过程促使外源DNA进入细胞。此法简单、快速、有效，常用于外源基因的短暂表达研究。电穿孔法这也是一种将外源DNA导入宿主细胞的常用方法。操作时将外源DNA与宿主细胞混合于电穿孔中，在高频电流的作用下，细胞膜出现许多小孔，使外源DNA能进入宿主细胞。磷酸钙共沉淀法使外源DNA或重组质粒DNA与氯化钙溶液混合，形成DNA-磷酸钙微小颗粒，并加入到宿主细胞中，使颗粒沉积在细胞表面，以有利于宿主细胞摄取这些颗粒。脂质介导的基因导入利用脂质体将外源基因导入到真核细胞是一种常见的简单而快捷的基因导入方法。其原理是阳离子脂质体试剂与DNA混合后，形成一种稳定的脂质双层复合物，DNA被包在脂质体中间。这种脂质双层复合物可直接加到培养的细胞中，脂质体黏附到细胞表面并与细胞膜融合，DNA被释放到细胞质当中。进入细胞的基因，可在细胞酶的作用下进行表达。这种温和的基因转移方法，对细胞无损伤，因而其转移效率高显微注射法将外源基因通过毛细管，在显微镜下直接注射到受精卵的细胞核内。四、转染细胞的筛选质粒载体导入哺乳动物细胞，都只有一小部分细胞能成为稳定的转染细胞，因此要进行筛选。pBR322质粒上有两个抗菌素抗性基因:四环素抗性基因（Tetr）和氨苄青霉素抗性基因（Ampr）。Tetr上有插入位点BamHI和SalI;Ampr上有插入位点PstI。1.原理：（1）四环素：（2）氨苄青霉素抗性基因：2.pBR322抗菌素标记选择产生-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮酸，使碘-青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin）（蓝灰色）褪色。抑制细菌生长，但不杀死细菌。杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。（3）环丝氨酸：3.选择过程：如果在Tetr上插入外源DNA，导致四环素抗性基因失活，可用四环素加环丝氨酸平板培养基选择重组克隆。Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨酸杀死，保留下来；Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反而被环丝氨酸杀死。（1）四环素抗性插入失活无环丝氨酸培养基结论：只有那些在含有氨苄青霉素的平板上生长，在含有四环素加环丝氨酸平板培养基也生长的菌落，才有可能在其质粒中插入了外源DNA片段。五、得到产物编码真核蛋白质的外源基因在真核细胞中表达时，表达产物对细胞本身的影响不大，蛋白质本身也很少被降解。因此真核表达载体的启动子大多是可以持续表达的，无需诱导。在筛选出转染细胞后，持续培养，便可在上清液中得到表达产物。观