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Biacore的分析方法BiacoreTraining2直接结合样品（Sample）分析物（Analyte）配体（Ligand）直接检测BiacoreTraining3直接结合•使反应信号加强的直接结合--三明治法(sandwichapproach)分析物配体信号加强分子260002700028000290003000031000050100150200250300350400450时间sResponseRUBiacoreTraining4间接结合•抑制检测(溶液内竞争)检测游离的目标分子+Ç分析物被检测的目标分子BiacoreTraining5间接结合•芯片表面竞争检测分析物配体竞争分析物+Ç检测混合物信号BiacoreTraining6Biacore分析的基本步骤芯片表面预处理进样再生数据分析BiacoreTraining7芯片表面预处理偶联•什么是偶联?»利用共价结合将蛋白偶联在羧基化处理的葡聚糖芯片表面•须考虑的因素»偶联什么蛋白?»怎样偶联?»哪种偶联水平是恰当的?»应该选择哪种传感芯片?BiacoreTraining8芯片表面预处理偶联什么蛋白?•注意事项»蛋白分子量»蛋白质标签»官能团»纯度»化合价(结合位点的数目)»偶联蛋白的活性保持»pI(等电点)»可利用的蛋白量»检测条件的选择BiacoreTraining9芯片表面预处理怎样偶联?•直接偶联»共价化学键»常为不均一的表面»高偶联量AmineLigandThiolSurfaceThiolMaleimideAldehydeStreptavidin-BiotinRAM-MabAnti-GST-GSTNTA-6HisAnti-FLAG-FLAGAnti-His–6Hisanalyteligandanalyteligandcapturingmolecule•捕获»位点特异性»选择的配体从天然样品中被捕获»低偶联量BiacoreTraining10氨基偶联（AmineCoupling）•活化=EDC/NHS注射Æ表面酯化•配体偶联=和配体上的氨基发生反应•封闭=用乙醇胺封闭芯片上多余的有活性的羧基活化配体偶连封闭BiacoreTraining11如何选择偶联策略：由配体性质决定•不稳定的配体捕获•不纯的配体捕获•共价结合后发现活性丢失•酸性配体•再生困难尝试其他官能团(e.g.巯基)捕获或改变结合化学键(e.g.巯基偶连)捕获BiacoreTraining12蛋白质等电点(pI)•在该pH下目标蛋白不带电荷•pHpI:目标蛋白带正电荷•pHpI:目标蛋白带负电荷BiacoreTraining13预结合（Pre-concentration）•配体通过静电效应，聚集在芯片表面3.5pHpIpHpIligandisolectricpointpIpH3.5ligandisolectricpointpIligandisolectricpointpIsurfacepK3.5asurfacepK3.5asurfacepK3.5a»有效的预结合pH范围处于芯片表面的pka和配体的蛋白等电点(pI)之间.»缓冲液中的离子强度必须较低»不完全的预结合可以部分地被增高的配体浓度所补充BiacoreTraining14偶联pH的选择(1)•必须根据实验的尝试找到最适的偶联pH•pH3.5时，芯片表面的葡聚糖带负电•偶连缓冲液的pH应该高于3.5,但低于配体蛋白的等电点•对许多蛋白来说,适合使用10mMNaAc缓冲液(pH4.5)BiacoreTraining15偶联pH的选择(2)•偶联时尝试使用溶于不同pH环境内的配体•预结合能提供有用但不完整的信息，进一步在优化偶联环境时…BiacoreTraining16偶连pH的选择(3)•为了实验条件最优化，整个偶联过程都必须被测试BiacoreTraining17偶联水平•配体偶联水平决定了芯片表面和分析物分子的结合能力•不同应用所需的偶联水平也不同•Rmax描述了芯片表面的最大蛋白结合量mLmaxSRMWligandMWanalyteR××=RL=偶联水平Sm=化学计量比•理论的Rmax往往高于实际的RmaxBiacoreTraining18练习–计算RL如果希望Rmax是100RU，应该在芯片上偶联多少配体?AnalyteMW=25,000DaLigandMW=150,000DaSm=1Rmax=100RUmLmaxSRMWligandMWanalyteR××=BiacoreTraining19使用targetingwizard控制偶联水平•无需进行大量的猜测工作!»使用预结合估计蛋白结合比率»冲洗»芯片表面的活化»以“脉冲”方式加入配体直至达到目标水平(第一次进样长度由预结合结果确定)»芯片表面多余位点的封闭BiacoreTraining20传感芯片的种类BiacoreTraining21传感芯片CM5•羧基化的葡聚糖表面•最常用的传感芯片•卓越的化学稳定性BiacoreTraining22传感芯片CM4和CM3•传感芯片CM4»羧基化的葡聚糖表面，羧基化程度低于CM5(所带的负电荷较少)»减少了对带强正电荷蛋白的非特异性结合，例如在细胞的水解样品和匀浆中»比较容易得到较低的Rmax，便于进行动力学研究•传感芯片CM3»羧基化的葡聚糖表面»葡聚糖链长度较CM5短,但羧基化程度相同»适用于细胞、病毒和多组分的混合物»便于得到较低的偶联水平BiacoreTraining23传感芯片C1•不含葡聚糖的羧基表面•适用于小型分子颗粒如细胞、病毒以及一些不需葡聚糖的研究的应用BiacoreTraining24传感芯片SA•在羧基化的葡聚糖表面覆盖了一层链霉生物素（streptavidin）•非常适合用于捕获生物素标记的DNA大片段，进行核酸之间的相互作用研究•可捕获生物素标记的配体，如糖类、肽段，蛋白质，DNA等BiacoreTraining25传感芯片NTA•在羧基化的葡聚糖表面覆盖了一层氨三乙酸（NTA）•通过金属螯合作用捕获带有末端组氨酸修饰（His-tagged）的配体蛋白分子•空间定向结合能很好地保持生物分子的空间结构•只需普通的再生条件BiacoreTraining26传感芯片HPA•疏水表面•适用于单层脂质分子和膜相关蛋白的相互作用分析•为细胞膜相关蛋白的相互作用分析提供了增溶技术•研究细胞膜受体在膜环境内与配体的相互作用BiacoreTraining27传感芯片L1»在羧基化的葡聚糖表面覆盖了一层亲脂物质»适用于在保持磷脂双分子层的结构的同时，快速和高重复性地捕获脂质体分子»不需对锚定的分子进行合并BiacoreTraining28传感芯片–总结•CM5:最常用的传感芯片•CM4:为获取更低的Rmax，并减少类似于在天然样品中发生的非特异性结合•CM3:为获取更低的配体偶联水平，应用于细胞、病毒和其他大分子量的待分析物•C1:适用于小型分子颗粒如细胞、病毒以及一些不需葡聚糖的研究的应用•SA:捕获生物素标记的配体•NTA:捕获His-tag修饰的配体•HPA:构建细胞膜的研究模型•L1:直接捕获脂质体分子并维持其活性BiacoreTraining29Biacore分析的基本步骤芯片表面预处理进样再生数据分析BiacoreTraining30不同的“Inject”种类•不同的进样种类提供了不同性质的实验结果:»QUICKINJECT:样品用量低，但有可能发生样品和缓冲液的混合污染»INJECT:样品用量中等，混合污染的可能性小»KINJECT:样品和缓冲液能得到最大程度的分离，但样品消耗量相对较大BiacoreTraining32结合与容积差（BulkEffects）•容积差因进样缓冲液和样品溶液折射率的不同而产生BulkBuffer1Binding+BulkBuffer1BiacoreTraining33对照表面（Referencesurfaces）•如果样品溶解缓冲液和仪器运行缓冲液成分不同，容积差可通过设置对照表面来消除•对照表面应该设置在结合反应表面的上游•当对进样过程进行分析时，对照表面的消减对检测结果非常重要BiacoreTraining34对照表面的设计•空白表面»适用于大多数实验»检查和葡聚糖表面相关的非特异性结合•经活化-失活处理的表面»按照偶联的步骤处理芯片，但不偶联配体»减少了芯片表面携带的负电荷，从而减少非特异性结合•偶联了伪装配体（dummyligand）的表面»将一种不与分析物结合的蛋白偶联于芯片上，而且与真实配体的偶联水平相同BiacoreTraining35样品注意事项•样品是否均一?•分析物的纯度如何?•分析物是否有活性?•样品是否容易发生聚合?•是否存在非特异性结合?•哪种缓冲液最适用?•应该采取怎样的进样时间?BiacoreTraining36必需的缓冲液条件•必须以0.2µm膜过滤并抽气•绝大多数常用的缓冲液体系都适用于Biacore•如果可能的话，在仪器运行缓冲液中加入表面活性剂P20•该研究分子是否需要特殊的添加剂?•样品是否需有机溶剂处理以增加溶解度»相关有机溶剂和Biacore的兼容性请参阅仪器手册BiacoreTraining37芯片表面测试•在实际分析开始前，进行一次进样操作•使用常规的分析物浓度•传感图能提供有用的分子相互作用信息•用来估计对照表面上的非特异性结合水平-400-20002004006008001000120050100150200250300TimesResponseRU对照表面活化表面BiacoreTraining38Biacore分析的基本步骤芯片表面预处理进样再生数据分析BiacoreTraining39再生•将和配体结合的分析物分子从芯片表面彻底除去•必须保持芯片表面的活性•有效的再生对获得高质量的分析数据至关重要！BiacoreTraining40测试再生的环境•有效的再生能够去除所有结合的分析物分子•重复对分析物做一次进样，以检测是否配体维持了原有的活性•结合和再生的过程必须进行多次重复，以完全确保选择的再生环境的有效性Cycle1Cycle2goodbadResponseTimeBiacoreTraining41再生环境的选择•最适的再生环境内因“配体-分析物”复合体的结构而异•相对于可检测的分子相互作用的广泛性，再生条件可选择的范围相对较小•当配体分子是蛋白质时，建议可选择的再生起始测试条件:1.低pH(10mMglycine-HCl,从pH3至pH1.5)2.乙烯乙二醇（Ethyleneglycol）(50%,75%和100%)3.高pH(1-100mMNaOH)4.MgCl2(1-4M)BiacoreTraining42从结合水平和基线的变化趋势看再生效率(1)•在常规情况下»理想的再生:»通过多次的进样，结合曲线都基本维持稳定，和第一次进样相比，响应值的变化在10%之内»过于温和的环境:»结合曲线逐渐降低，基线值逐渐增高»过于苛刻的环境:»结合曲线逐渐降低，基线维持稳定或逐渐降低BiacoreTraining43从结合水平和基线的变化趋势看再生效率(2)结合曲线的变化BiacoreTraining44从结合水平和基线的变化趋势看再生效率(3)基线的变化BiacoreTraining45总结•设定偶l联方法»偶联什么？»怎样偶联？»偶联量是多少？•估算配体的最大结合能力•设置合适的对照表面•建立合适的再生条件•确认芯片表面的稳定性»监测基线稳定性»监测结合能力的改变