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一、显微镜技术1、分辨率（resolution）：用于表示人眼和仪器，能够辨别两点之间最小距离的标志，是衡量显微镜性能的重要指标。人眼的分辨率由人眼的生理结构决定。光镜由光波波长和物镜数值孔径决定。电镜由电子束半波长决定。分辨率极限：人眼（0.1mm）；光镜（0.2μm）；电镜（0.2nm）。显微镜技术优化核心是提高分辨率，体现在两个方面：（1）光源的采用（2）样品制备和信号呈现方法使信噪比提高。2、显微镜分类：（1）光学显微镜：普通光学显微镜；荧光显微镜（激光扫描共聚焦显微镜、超高分辨率荧光显微镜、活细胞荧光工作站）；相差显微镜：观察活细胞；微分干涉相差显微镜（DIC）：活细胞三维立体投影影像（2）电子显微镜：透射电子显微镜（TEM）；扫描电子显微镜（SEM）；分析电子显微镜；高压电子显微镜；冷冻电子显微镜（3）扫描探针显微镜：原子力显微镜3、普通光学显微镜主要三部分：聚光镜、物镜、目镜；光源：可见光样品制备5步：固定（甲醛）；脱水（乙醇）；包埋（石蜡）；冰冻切片（1-10μm）；苏木精伊红染色（HE染色）4、荧光显微镜光源：高压汞灯、弧光灯荧光的来源：（1）细胞和组织自发荧光（2）外源导入荧光蛋白：动态检测、活体检测、长时间检测、容易融合（3）荧光染料：吖啶橙染色DNA（绿）、RNA（橙）（4）荧光标记抗体：荧光染料与抗体共价结合（5）荧光探针：金属离子探针、细胞内pH值~、细胞内活性氧~、线粒体跨膜电位~。5、荧光素（Fluorphore）：吸收能量后具有发光现象的物质，通常为吸收短波长的能量后发散出长波长的光，并随照射停止而消失。荧光素发射光减弱（光漂白）或消失（淬灭）。6、激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）：以激光作为激发光源，采用光源针孔与检测针孔共聚焦技术，对样本进行断层扫描，以获得高分辨率光学切片的荧光显微镜系统。7、简述激光扫描共聚焦显微镜的原理（光源点,物点,像点，三点共轭）以激光作为激发光源；结构上采用双针孔装置，形成物像共聚焦的独特设计；激光经过聚光镜焦平面上针孔形成点光源，再经物镜在焦平面对样品逐点扫描。样品上每个照射点经反射镜在像焦平面的探测针孔处成像，被光电倍增管探测器接收，转为数字信号传输至计算机，最终在屏幕上聚合成清晰的整个焦平面共聚焦图像。8、激光扫描共聚焦显微镜的功能：（1）薄层断层扫描（光学切片）（2）多通道同时扫描：激光共聚焦显微镜可以多激光多通道同时扫描（3）ZOOM成像：在不变换镜头的情况下，对某幅图片的局部放大，并进行精细逐点扫描成像，获得高分辨率图像。（4）多维度扫描：Z轴扫描（垂直）或T扫描（时间）（5）荧光定量分析9、激光扫描共聚焦显微镜技术在医学及生物学研究中的应用（1）静态：分子定位、定量分析、分子间相互作用（2）动态：分子或细胞活动的动态变化：蛋白质的移位；蛋白质相互作用的研究（FRET)；分子运动的测量(FRAP)；离子浓度变化趋势的检测10、简述激光扫描共焦显微镜与荧光显微镜的差别。LSCM的优缺点。类别LSCM荧光显微镜光源激光（紫外光、可见光、近红外）短波长光源（多为紫外光）照明方式点照明、逐点扫描落射式样本信号焦平面的样本信号，几乎无次级荧光干扰可有多个平面的样本信号，伴随相邻部位干扰图像采集系统荧光信号被PMT探测器接收实时观测，数字化图像，可以进行图像处理和定量分析照相机的原理LSCM的优缺点：LSCM优点：（1）高水平分辨率：0.18μm（2）高垂直分辨率：沿Z轴逐层扫描（3）高灵敏度，信噪比良好（4）能定时、定位、定性、定量缺点：（1）分辨率极限：0.15μm（2）观测厚度：50-100μm（3）逐点扫描，成像速度慢（4）伪彩色11、LSCM和电子显微镜的区别激光共聚焦显微镜电子显微镜工作原理光波的透射电子的透射成像效果微米级（荧光标记）纳米级研究目的观察分布、表达量观察细微结构12、超高分辨率荧光显微镜的原理：“突破”衍射极限，提高分辨率（50nm）（1）基于点扩展函数调制：点扩展函数变小（2）基于随机单分子定位：不会有两个靠的很近的点同时亮起来13、电子显微镜：以电子束为光源，电磁场为透镜，利用电子信号成像，具有高分辨率和放大倍数的显微镜，用于研究组织和细胞的超微结构。14、电子束：又称电子射线，电子束带负电荷，具有光的波动性、可折射性，电镜利用电子束作为“光源”成像。15、透射电子：当样品厚度小于100nm时，部分电子可穿透样品，将穿透样品的电子叫做透射电子,利用透射电子信息成像的称为透射电镜。16、二次电子：在入射电子的轰击下,样品表面5-50nm深度激发出来的电子称为二次电子，利用二次电子信息成像的称为扫描电镜。17、TEM成像和工作原理：（1）电子束投射在样品上，部分电子直接穿透样品产生透射电子（2）带有样品信息的透射电子经成像系统放大，投射到荧光屏上（3）透射电子多，荧光屏亮；反之荧光屏暗，荧光屏的亮暗程度与样品微细结构一一对应，产生具有一定反差的黑白影像18、超薄切片：将环氧树脂包埋的组织块切成100nm以下的薄切片称为超薄切片，超薄切片经电子染色后在TEM下观察组织细胞内部的超微结构。19、血管灌注固定：血管灌注固定是通过血管灌注适量的固定剂，在动物体内把活细胞在原位及时固定。血管灌注固定速度快，固定均匀，可减少离体或死亡后缺氧引起自发性的变化影响，特别是对脑、心肌、肾脏等对缺氧比较敏感的组织尤为重要。20、TEM的样品制备（1）超薄切片技术（9步）：取材（1分钟内将新鲜标本放入固定液）；预固定（新鲜配制2.5%戊二醛）；后固定（1%锇酸）；脱水（乙醇和丙酮）；浸透；包埋聚合（环氧树脂）；修块；切片（半薄切片：500nm;超薄切片：50-100nm）；染色（甲苯胺蓝）。（2）负染色技术：通过重金属盐在样品四周堆积,加强样品外周的电子密度，衬托样品的形态和大小。（染色液：磷钨酸、醋酸双氧铀）（3）免疫电镜技术：是将免疫学方法与电子显微镜技术相结合，利用抗原与抗体特异结合的特性，在超微结构水平定位特异大分子的技术。A、包埋前法：先免疫标记，后包埋，制备超薄切片；包埋后法：先包埋，制备超薄切片，后免疫标记；冷冻超薄切片法：将标本直接切成超薄切片，进行免疫反应，电镜观察。B、推荐固定液：3～4％多聚甲醛＋0.1％～0.5％戊二醛；C、要求：免疫组化结果一定要好；固定液配制要新鲜；尽快处理标本。21、在样本制备过程中为什么要进行半薄切片定位？（1）选取超薄切片的部位，超薄切片的面积一般要小于0.5mm2，要经过半薄切片来选取有意义的部位。（2）对同一部位进行光、电镜对比观察，在较大范围内了解组织结构、病变部位和病理性质，有利于更确切的认识超薄切片中的结构及其相互关系。22、要了解细胞内部的超微结构变化，选择哪种类型的电镜，为保证生物样品良好的超微结构，在样本取材及固定时应注意什么？了解细胞内部的超微结构变化应选择透射电子显微镜（TEM）。为保证良好的超微结构，在样本取材及固定时应注意做到快、小、轻、冷。（1）快：在1分钟内固定组织，尽可能保持其活体状态，因为瞬间的拖延都会导致细胞超微结构的变化。（2）小：组织块必须切成1mm³的小块，组织块过大其中央得不到及时固定会发生细胞自溶现象。（3）轻：不要牵拉、锯、挤压组织。要用锐利的刀片，避免细胞受到损伤。（4）冷：低温操作，4℃保存，降低酶的活性，避免组织发生自溶。23、在透射电镜样本取材时，样本不可大于1mm3，并在1分钟以内完成固定。请问如果组织块过大会出现什么后果？没有及时固定的组织电镜下会出现何种改变？由于电镜固定液戊二醛对组织的穿透能力较弱，如果组织块过大会造成组织中心得不到及时固定，在电镜下没有得到及时固定组织细胞的细胞器会发生变性，特别是对缺血乏氧十分敏感的线粒体会出现肿胀和空泡变性等改变。24、如何描述一张电镜图片。（1）细胞整体：大小、形状、细胞膜和突起以及细胞间的连接（2）细胞核：大小、形状、核仁、染色质等（3）细胞质：各种细胞器的数量、分布、形状等（Mit、RER、Ri、Ly、Gol…）25、TEM在医学领域的应用（1）细胞器、组织器官的超微结构（2）原核细胞、病毒的超微结构（3）超微病理变化（病理诊断）（4）细胞成分定位（5）生物材料复合体26、扫描电镜的样品制备过程（6步）：取材（充分暴露并保护观察面：5x5mm）；清洗（用生理盐水仔细漂洗观察面）；固定（2.5%戊二醛和1%锇酸固定）；脱水（丙酮逐级脱水，醋酸异戊酯置换）；干燥：（临界点干燥）；镀膜（离子溅射镀膜或真空镀膜）27、扫描电子显微镜在生物医学领域的应用：（1）血细胞、细菌、培养细胞的整体形态、表面突起和细胞间相互关系（2）消化道,呼吸道,血管等空腔组织的表面结构（3）植物、昆虫等（4）生物材料复合体28、扫描电镜用于观察组织表面结构，因此取材时必需要充分暴露组织表面结构，请问常用的方法和注意事项有哪些？在样品取材时必须保护好并充分暴露观察面，避免损伤要观察的部位，易卷曲的样品,如气管、胃、肠粘膜可固定在滤纸上展平，要将表面的血液、粘液用生理盐水或缓冲液仔细漂洗干净，对于粘稠附着物还可以使用酶消化法。29、请从成像信号、样品制备、图象特点和应用几方面对TEM和SEM做以比较。类别TMESEM分辨率0.1nm0.6nm放大100万倍80万倍成像信号透射电子信号利用二次电子信号成像样品制备制成超薄切片等，制备过程复杂方法较简单，标本可大而厚图像特点二维结构，平面图像三维结构图像，立体感强应用观察组织细胞内部的超微结构观察样品表面及其断面立体形貌二、细胞化学技术1、原位观察化学成分，提供的信息：（1）推测化学成分（大分子）的可能性（2）观察生理、病理状态下大分子动态变化（3）指示大分子所在的特异细胞，观察细胞在组织的分布2、细胞化学技术：在保持细胞结构完整的条件下，借助细胞中的化学反应在细胞原位确定化学成分的分布及这些成分在细胞活动中的动态变化的技术，用以阐明细胞化学成分、结构和功能的关系。包括酶细胞化学技术、免疫细胞化学技术、放射自显影技术和原位杂交等。3、细胞化学技术特点：（1）原位（保持组织细胞的天然结构）（2）细胞化学反应及可见性（3）细胞化学反应的观察：显微镜、流式4、细胞化学技术主要包括：（1）酶细胞化学技术：1.酶+底物反应；2.显色反应。显示酶在细胞内的分布及酶活性强弱。（2）免疫细胞化学技术：1.抗原+抗体反应；2.显色反应（3）放射自显影：1.放射性同位素衰变和射线的释放反应；2.感光（4）原位杂交技术等：1.核酸杂交反应；2.显色反应5、细胞化学技术通用流程：（1）组织细胞固定（保持原位）（2）石蜡包埋或冷冻（3）切片（利于反应，利于观察）（4）化学反应（5）显色反应6、免疫组织化学、免疫细胞化学技术（IHC）：把组织细胞中的特异分子作为抗原，利用抗原抗体特异性结合的特点，用显微镜下可见的标记物直接或间接标记抗体或抗原抗体复合物，使之在显微镜下可见，从而间接地显示抗原，达到在细胞或细胞器水平定位特异分子的目的。特异蛋白质定位：1.大分子的组织和细胞水平定位2.细胞内大分子的固定亚细胞定位3.细胞内大分子的转运或移位4.细胞内定位固定的大分子的动态变化5.细胞内大分子的共定位7、免疫细胞化学技术原理一、抗原：凡能刺激机体产生抗体并能与抗体特异结合的物质称为抗原，酶、受体、抗体二、抗体：结合抗原、结合抗种属抗体：识别一抗的种属特异性，并能够因此结合一抗,称为二抗三、免疫反应的特异性四、免疫细胞化学反应：（1）直接法；（2）间接法优点：避免标记造成对抗体与抗原结合的影响；信号增强；标记物多。五、标记物的显色反应（光镜和电镜）：（1）免疫荧光；（2）免疫酶；（3）免疫胶体金颗粒8、免疫荧光技术(IF)：免疫荧光技术将荧光素作为标记物使组织细胞中形成的抗原抗体复合物在荧光显微镜下可见，从而显示抗原物质的定位。（培养细胞、动物组织）9、免疫荧光技术优点：（1）双重或多重标记，同时比较不同分子的位置及量的关系。（2）双重或多重标记，同时染色细胞器和感兴趣分子，可显示分子的亚细胞定位信息。（3）