植物组织中丙二醛含量的测定

植物组织中丙二醛含量的测定一、原理植物器官衰老或在逆境下遭受伤害，往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛(malondialdehydeMDA)是膜脂过氧化作用的产物之一，其含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度。丙二醛在酸性和高温条件，可以与硫代巴比妥酸(TBA)反应,形成在532nm波长处有最大光吸收的有色三甲基复合物，该复合物的吸光系数为155𝑚𝑚𝑜𝑙/(𝐿·𝑐𝑚)，并且在600nm处有最小光吸收。可按公式：𝐴532－𝐴600=155000×𝐶×𝐿①算出MDA浓度𝐶(𝜇𝑚𝑜𝑙/𝐿)，进一步算出单位质量组织中MDA含量(𝜇𝑚𝑜𝑙/𝑔)。式中A532和A600分别表示532nm和600nm处的吸光度值。𝐿为比色杯厚度(𝑐𝑚)。需要指出的是，植物组织中糖类物质对MDA-TBA反应有干扰作用。为消除这种干扰，经试验，可用下列公式消除由蔗糖引起的误差。𝐶(𝜇𝑚𝑜𝑙/𝐿)=6.45(𝐴532－𝐴600)−0.56𝐴450②式中：A450、A532和A600分别表示450nm、532nm和600nm波长下的吸光度值。用公式②算出植物样品提取液中MDA的浓度后，进一步算出其在植物组织中的含量。二、实验材料、试剂与仪器设备（一）实验材料海滨锦葵叶片。（二）试剂1、5%三氯乙酸(TCA)。2、0.67%（W/V）硫代巴比妥酸(TBA)溶液：称取硫代巴比妥酸0.67g溶于10％TCA溶解并用其定容至l00mL。（三）仪器设备研钵，恒温水浴锅，分光光度计，冷冻离心机，天平，刻度试管，可调加样器三、实验步骤1.MDA的提取：称取植物材料0.5g，剪碎，加入5%TCA5mL，研磨至匀浆，匀浆在3000r/min离心10min，上清液为样品提取液。2.显色反应和测定：吸取离心的上清液2mL，加入2mL0.67%TBA溶液，摇匀。将试管放入沸水浴中煮沸10min(自试管内溶液中出现小气泡开始计时)，取出试管并冷却，3000r/min再离心15min。3．取上清液并量其体积。以0.67％TBA溶液为空白测定532nm、600nm和450nm处的吸光度值，并按公式②算出MDA浓度。注意：1．可溶性糖与TBA显色反应的产物在532nm也有吸收（最大吸收在450nm），当植物处于干旱、高温、低温等逆境时可溶性糖含量会增高，必要时要排除可溶性糖的干扰。2．低浓度的铁离子能增强MDA与TBA的显色反应，当植物组织中铁离子浓度过低时应补充Fe3+（最终浓度为0.5nmol·L-1）3．如待测液浑浊，可适当增加离心力及时间，最好使用低温离心机离心。