植物组织培养技术1(1)

植物组织培养技术李兰芝生物安全科学技术学院AGlimpseofPlantTissueCulture主要内容：概述植物组织培养含义组织培养的类型植物组织培养的发展简史植物组织培养在农业上的应用本节教学目的与要求(1)掌握组织培养的概念和类型；(2)掌握组织培养的特点；(3)了解组织培养发展史；(4)初步掌握组织培养在农业实践上的应用。一、什么是植物组织培养WhatIsTissueCulture?Orinvitroculture?Ormicropropagation?（一）概念：器官（organ)：根、茎、叶、花、果实、种子组织（tissue)：花药、胚珠、胚、胚乳、形成层等植物组织培养（Tissueculture）是指用无菌方法使植物体的离体（invitro)器官、组织和细胞在人为提供的条件下生长和发育的所有培养技术的总称，也称之为离体培养（Invitroculture）或试管培养。CharacteristicsofPlantTissueCultureTechniques①培养条件可以人为控制②生长周期短，繁殖率高植物组织培养特点③管理方便，利于工厂化生产和自动化控制（二）植物组织培养的理论基础—细胞全能性1、细胞全能性（celltotipotency)：植物体的每一个具有完整细胞核的细胞都具有该物种全部遗传的物质，在一定条件下具有发育成完整植物体的潜在能力。2、植物细胞全能性的表达脱分化（dedifferentiation)：将已分化的不分裂的静止细胞，放在培养基上培养后，细胞重新进入分裂状态。一个成熟的细胞转变为分生状态的过程叫脱分化。一个细胞一旦沿着某一条特定的途径分化发育后，一般不会再回复到未分化状态，但在组织培养条件下，可能发生脱分化和再分化。再分化（redifferentiation):经脱分化的组织或细胞在一定的培养条件下可转变为各种不同的细胞类型，形成完整植株的过程。脱分化愈伤组织再分化根芽再生植株3、植物组织培养过程合适的外植体离体的植物器官、组织、细胞移栽外植体（explant)：由活体（invivo)植物体上切取下来的，用于组织培养的各种接种材料。包括各种器官、组织、细胞或原生质体等。即能被诱发产生无性增殖系的器官或组织切段。胡萝卜离体根愈伤组织（callus）在人工培养基上由外植体上形成的一团无序生长状态的薄壁细胞。指经细胞与组织培养产生的可传代的未分化细胞。4、组织培养植株再生的途径魔芋胚状体1）、体细胞胚胎发生途径（胚状体发生途径）：是指在组织培养中起源于一个非合子细胞，经过胚胎发生和胚胎发育过程（经过原胚、球形胚、心形胚、鱼雷胚和子叶胚5个时期），形成具有双极性的胚状结构，而发育成再生植株的途径。胚状体发生途径外植体脱分化愈伤组织胚状体再生植株再分化2）、器官发生途径：由愈伤组织或外植体诱导形成不定根或不定芽，再获得再生植株的方法。百合鳞叶培养外植体器官发生途径愈伤组织芽分化再生苗胚状体小麦愈伤组织器官发生途径外植体愈伤组织芽根再生植株脱分化再分化高生长素(1,2-D)高(生长素/细胞分裂素)低(生长素/细胞分裂素)器官发生途径愈伤组织按培养材料分为（Gamborg等)：愈伤组织培养器官培养细胞培养原生质体培养最为常见的组织培养悬浮细胞培养单细胞培养胚、胚乳、珠心、子房、根、茎、叶、花和幼果的部分组织的培养（三）、植物组织培养的类型根据培养器官的不同：叶培养、根培养、花药培养、胚珠培养、茎尖培养等烟草（三）、植物组织培养的类型根据培养方式：固体培养、液体培养固体培养：将培养物放在含有琼脂等固化剂的培养基表面进行培养。液体培养：将培养物放在未加固化剂的培养基内培养，一般需进行震荡，又称液体震荡培养。（三）、植物组织培养的类型固体培养液体培养(1)固体培养法是最常用的方法。该方法简单，易行，但养分分布不均，生长速度不均衡，并常有褐化中毒现象发生。(2)液体培养法由于液体中氧气含量较少，常用振动培养的方法以确保氧气的供给往复式摇床或旋转式摇床进行培养，速度一般为50-200r／min，这种定期浸没的方法，既能使培养基均一，又能保证氧气的供给。固体培养、液体培养的特点：根据培养物量的多少：大量培养、微量培养。根据培养过程中是否需光：光培养、暗培养根据培养方法的不同：平板培养、微室培养、悬浮培养等（三）、植物组织培养的类型按培养过程分为:初代培养和继代培养初代培养（Primaryculture）：指外植体的最初培养。继代培养（Subculture）：将初代培养得到的培养体移植于新鲜培养基中这种反复多次移植的培养，称为继代培养。（三）、植物组织培养的类型二、植物组织培养发展简史1、萌芽阶段：(从20世纪初到30年代中）1838-1839年，德国科学家Schleide和Schwann发表了细胞学说，奠定了组织培养的理论基础。1902年，德国植物学家Haberlandt根据细胞学说，提出植物细胞全能性（totipotency）理论。1904年，Hanning最先成功地培养了萝卜和辣根菜的胚。1922年，Knudson采用胚培养法获得大量兰花幼苗。克服其种子发芽困难的问题1925年：Laibach亚麻种间杂交幼胚培养得到杂种玉米成熟胚的培养Haberlandt：观点：贡献：提出细胞全能性首次进行离体细胞培养高等植物的组织和器官可以分割成单个细胞小野芝麻和凤眼兰的栅栏细胞和虎眼万年青属表皮细胞无分裂细胞高度分化+培养基中无生长激素Knop+蔗糖1934年，美国植物生理学家White用番茄根尖建立起第一个活跃生长的无性繁殖系，从而使非胚器官的培养首先获得成功。2、奠基阶段（从20世纪30年代末到50年代中）1934年：Gautherete培养山毛杨、黑杨形成层组织产生了Callus1937年：White发现3种B族维生素和IAA对植物生长有用1939年：Gautherete培养胡萝卜根小外植体成功1939年：White培养烟草种间杂种幼茎切段原形成层成功1939年：Nobecourt培养胡萝卜根块茎薄壁组织成功组织培养的奠基人3、快速发展和应用阶段（从20世纪50年代末至今）1958年，英国科学家Steward等用胡萝卜根的愈伤组织细胞进行悬浮培养，成功诱导出胚状体并分化为完整的小植株。这是第一次实现人工体细胞胚，是植物组织培养的第一个突破。1960年英国学者Cocking用酶法分离原生质体成功。这是植物组织培养的第二个突破。1962年，Murashinge和Skoog在烟草培养中筛选出至今仍被广泛使用的MS培养基。1964-1966年，印度科学家Guha和Maheswari在曼陀罗花药培养中首次由花粉诱导得到了单倍体植株。1972年，Carlson通过两个种的烟草原生质体融合培养，获得了第一个体细胞杂交的杂种植株。……三、应用领域1、快速繁殖2、种苗脱毒3、远缘杂交8、植物性药物和生物制品的生产7、基因工程6、种质保存4、突变育种5、单倍体育种四、植物组织培养在技术上的发展研究材料范围逐步扩大培养方法逐步完善培养基不断改进实验手段逐步完备植物再生植株的途径小结：(1)植物组织培养是指分离单个或多个细胞或植物体的一部分，在人工配制的培养基上进行培养，使之长成一株完整植物体的过程。(2)类型：按照外植体的不同，分为植株培养、胚胎培养、器官培养、细胞培养和原生质体培养5种类型。(3)组织培养特点：培养条件可以人为控制；生长周期短，繁殖率高；管理方便，利于工厂化生产的突出特点，因而发展迅速。(4)组织培养技术在农业生产上的应用主要体现于以下几个方面：快速繁殖优良苗木；获得脱毒苗；育种上应用；工厂化育苗。植物组织培养实验室构建及操作技术植物组织培养学本节教学目的与要求：(1)掌握组织培养实验室的设计；(2)掌握组织培养常用的实验仪器设备及其使用方法；(3)掌握调控组织培养的主要环境条件。(4)掌握灭菌和消毒的区别；(5)掌握灭菌的不同方法和具体操作过程；商业性组织培养实验室和小工厂的设计与主要设备培养基及其配制外植体的选择与培养试管苗的驯化与移栽本节主要内容1、培养器皿的清洗；2、培养基的配制、分装和高压灭菌；3、无菌操作——材料的表面灭菌和接种；4、将培养物放到培养室培养；5、试管苗的驯化、移栽和初期管理。一商业性组织培养实验室和小工厂的设计与主要设备一般组织培养的操作工序：准备室温室驯化室培养室无菌操作室缓冲室实验室组成一、设计：二、仪器设备和器皿用具1、超净工作台或接种箱2、空调3、除湿机或加湿器4、恒温培养箱5、高压灭菌锅6、冰箱7、天平8、显微镜9、水浴锅10、摇床与转床11、蒸馏水发生器12、酸度计13、离心机（一）常见仪器设备组织培养实验室的设计与主要设备1、培养器皿：试管、三角瓶、培养皿、圆形培养瓶、果酱瓶2、分注器3、离心管4、刻度移液管5、细菌过滤器6、实验器皿：量筒、烧杯、容量瓶、试剂瓶、塑料瓶、酒精灯等。组织培养实验室的设计与主要设备（二）各类玻璃器皿1、镊子：尖头镊子、枪形镊子2、剪子3、解剖刀4、接种针5、钻孔器组织培养实验室的设计与主要设备（三）器械用具二培养基及其配制本节目的要求：(1)一般掌握培养基的种类、特点；(2)掌握基本培养基的配方；(3)一般掌握培养基的组成成分和适宜的剂量；(4)掌握培养基母液和常用培养基的配制方法；(5)熟练掌握培养基的灭菌方法；(6)一般掌握培养基的筛选办法。一、培养基的成分培养基及其配制其它添加物碳水化合物植物生长调节剂有机营养物无机营养物培养基组成1、无机营养元素(inorganicelement)1)大量元素：指浓度大于0.5mmol／L的元素。[N、P、K、Mg、S和Ca等]。2)微量元素：指小于0.5mmol／L的元素。[Fe，B，Mn，Cu，Mo，Co等]。培养基及其配制2、有机化合物(organiccompound)最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖也是较好的碳源。使用浓度在1%—5%，常用3%作用：碳源；维持培养基渗透压。（1）碳水化合物培养基及其配制在细胞里主要是以各种辅酶的形式参与多种代谢活动。种类：VBl(盐酸硫胺素)、VB6(盐酸吡哆醇)、Vpp(烟酸)、Vc（抗坏血酸）、VH(生物素)、VB11(叶酸)、VB12（钴胺素)等。使用浓度：一般用量为0.1—1.0mg／L。（2）维生素(vitamin)培养基及其配制又叫环己六醇，在糖类的相互转化中起重要作用。使用浓度：一般为lOOmg／L，作用：适当使用肌醇，能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽的形成。对组织和细胞的繁殖、分化有促进作用，对细胞壁的形成也有作用。（3）肌醇培养基及其配制作用：是很好的有机氮源，可直接被细胞吸收利用。种类：最常用的是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸，谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等。使用浓度：为10—200mg／L。（4）氨基酸(alminoacide）培养基及其配制3、有机附加物（天然复合物）10%—20%150-200ml／L150—200g／L0.01%-0.05%浓度：培养基及其配制有机附加物椰乳香蕉马铃薯酵母提取液4、植物生长调节物质(hormone)赤霉素（gibberellicacid）细胞分裂素类(cytokinin)生长素类(auxin)培养基及其配制*作用：主要被用于诱导愈伤组织形成；促进细胞脱分化；促进细胞伸长；促进生根。在促进生长方面，根对生长素最敏感。在极低的浓度下，(10-5—10-8mg／L)就可促进生长，其次是茎和芽。（1）生长素类培养基及其配制吲哚乙酸：IAA（indoaceticacid）萘乙酸：NAA（naphthaleneaceticacid）吲哚丁酸：IBA（indolebutyriacid）2,4-二氯苯氧乙酸：2,4—D(2,4-dichlorophenoxybutyricacid)*生长素种类：培养基及其配制IAA(吲哚乙酸)NAA(萘乙酸)IBA(吲哚丁酸)2,4—D(2,4