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分析化学结课作业常见蛋白质测定方法的总结与比较材料科学与技术学院林化13-1班刘旺衢1305341062014年6月北京林业大学June.2014常见蛋白质测定方法的总结与比较刘旺衢(北京林业大学材料科学与技术学院林化13-1班130534106,10083)蛋白质是构成生物体细胞组织的重要成分。食物中的蛋白质是人体中氮的唯一来源。具有糖类和脂肪不可替代的作用。蛋白质与营养代谢、细胞结构、酶、激素、病毒、免疫、物质运转、遗传等密切相关,是对人类最重要的物质之一。准确精密的测定蛋白质,关乎人类的生产、生活、生存。目前测定蛋白质含量的方法有多种,如凯氏定氮法、紫外吸收法、双缩脲法、考马斯亮蓝染色法、酚试剂法等几种方法,下面本文将总结比较这五种蛋白质的测定方法。一、凯氏定氮法凯氏定氮法是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。即在有催化剂的条件下,用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐,然后在碱性条件下将铵盐转化为氨,随水蒸气馏出并为过量的酸液吸收,再以标准酸滴定,就可计算出样品中的氮量。由于蛋白质含氮量比较恒定,可由其氮量计算蛋白质含量,故此法是经典的蛋白质定量方法。蛋白质是含氮的有机化合物。蛋白质与硫酸和催化剂一同加热消化,使蛋白质分解,分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离,用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定,根据酸的消耗量乘以换算系数计算蛋白质含量,即含氮量*6.25=蛋白含量。凯氏定氮法具有灵敏度高,样品用量少,最低可检出0.05mg氮;精密度、准确度高,平行误差一般小于0.5%;应用范围广,适用于一切形态的食品与生物样品;仪器装置简单,试剂廉价的优点。但也存在操作比较繁琐费时,特别是蒸馏定氮过程的效率低,不利于大批样品的测定;定氮的结果既包括有机氮,也包括无机氮,有机氮中除蛋白氮外,还包括非蛋白氮,测定的结果只能是粗蛋白质的含量;在蛋白质氨基酸构成有差异的2014年6月北京林业大学June.2014情况下,特别是大量含碱性氨基酸、氨基酸酞氨和小分子量氨基酸的蛋白质,其含氮量就高,必须要根据不同的样品选择对应的换算系数。但处理未知样品时,其误差就有变大的危险,一般可产生几个百分数的误差等缺点。总结:凯氏定氮法是标准的测蛋白质的含量的方法,有着较高的准确度和精密度,其对实验试剂、器材要求叫低,是一种适合广泛使用的蛋白质含量粗测方法。但由于将测蛋白质的含量转化为测氮的含量,这一替代的过程,使得可以通过添加三聚氰胺之类物质虚增蛋白质,危害食品安全和人民健康。总的来说,凯氏定氮法有优点也有缺陷,实际运用中可结合其他方法尽量减少缺陷。二、双缩脲法双缩脲是由两分子尿素缩合而成的化合物,在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色络合物,此反应即为双缩脲反应。含有两个或两个以上肽键的化合物都具有双缩脲反应。蛋白质含有多个肽键,在碱性溶液中能与Cu2+络合成紫红色化合物。其颜色深浅与蛋白质的浓度成正比,可以用比色法进行测定。由于双缩脲法是通过测蛋白质中的肽键的含量来测定蛋白质的含量,所以此方法的准确性比凯氏定氮法高。其次,它用来吸光光度法来测定含量,精确度高。但用双缩脲法测的灵敏度低,测定范围窄,样品需要量大。只能用于测定还有两个或两个以上肽键的蛋白质,有一定局限性。总结:双缩脲法的优点在于它用双缩脲试剂作为显色剂,用吸光光度法来测量蛋白质中肽键的含量,与凯氏定氮法相比已经有了改进,更精准的测定了蛋白质的含量。但它只能用于测定还有两个或两个以上肽键的蛋白质,且分析实验仪器较为复杂,不利于推广,仅使用于定性检测,不适用于定量检测。2014年6月北京林业大学June.2014三、紫外吸收法蛋白质分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键,使蛋白质具有吸收紫外光的性质,吸收峰在280nm处,其吸光度(即光密度值)与蛋白质含量成正比。此外,蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下,蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系,可以进行蛋白质含量的测定。紫外吸收法简便、灵敏、快速,不消耗样品,低浓度的盐类不干扰测定。特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测,利用280nm进行紫外检测,来判断蛋白质吸附或洗脱情况是最常用的方法。紫外吸光法特点是测定蛋白质含量的准确度较差,干扰物质多,在用标准曲线法测定蛋白质含量时,对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质,有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质,会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表,再进行计算的方法,加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的,虽然经过校正,测定的结果还是存在一定的误差。总结:紫外吸收法有很多优点,它简便、灵敏、快速,不消耗样品,而且测定后仍能回收使用。其通过蛋白质中特定的键对光的吸收性质来测量,可以避免加含氮物质虚增蛋白质的发生。但是实验测定时干扰较多,往往不能精确测定。四、酚试剂法此法的显色原理与双缩脲法是相同,只是加入了第二种试剂,即Folin—酚试剂,以增加显色量,从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深蓝色的原因是:在碱性条件下,蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。Folin—2014年6月北京林业大学June.2014酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原,产生深蓝色(钼蓝和钨蓝的混合物)。在一定的条件下,蓝色深度与蛋白的含量成正比。酚试剂法由于添加了Folin—酚试剂,以增加显色量,比双缩脲法灵敏的多。但是费时间较长,要精确控制操作时间,标准曲线也不是严格的直线形式,且专一性较差,干扰物质较多。对双缩脲反应发生干扰的离子,同样容易干扰反应。总结:酚试剂法是对双缩脲法的一种改进,它的灵敏度很高,但是时间长,显色剂不易制取,操作精度难度要求较大,且同样容易受干扰。五、考马斯亮蓝法考马斯亮蓝法是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。考马斯亮蓝是一种有机染料,在游离状态下呈红色,在稀酸溶液中与蛋白质的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基结合后变为蓝色,其最大吸收波长从465nm变为595nm,蛋白质在1-1000μg范围内,蛋白质-色素结合物在595nm波长下的吸光度与蛋白质含量成正比,故可用于蛋白质的定量测定。考马斯亮蓝与蛋白质结合反应十分迅速而稳定,2min左右即达到平衡,其结合物室温下1h内保持稳定,且在5-20min之间,颜色的稳定性最好。该法方法简便,易于操作,所用试剂较少,显色剂易于配制。干扰物质少,如糖、缓冲液、还原剂和络合剂等均不影响显色。用于不同蛋白质测定时有较大的偏差,在制作标准曲线时通常选用γ球蛋白为标准蛋白质,以减少这方面的偏差。标准曲线也有轻微的非线性,因而不能用Beer定律进行计算,而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。2014年6月北京林业大学June.2014总结:考马斯亮蓝法也是吸光光度法来测量蛋白质含量的方法。它的灵敏度与其他测蛋白质的方法相比是最高的,用时很短且结合稳定。但是由于试剂及仪器还是相对复杂,在生产生活中的应用可能受限。总的来说,五种蛋白质含量的测定方法各有有缺,有的简单易行,有的精确,有的廉价。在实际运用中,如果需要准确的定性定量检测蛋白质,确保安全,不妨可以多种方法一起使用,相互比较避免诸如凯氏定氮法不能区分含氮物质还是蛋白质,几种吸光光度的分析方法容易被干扰等劣势,从而准确精密的测出蛋白质的含量。
本文标题:常见蛋白质测定方法的总结与比较
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