灭菌及无菌空气的制备

发酵的一般流程种子扩大培养培养基配制空气除菌培养基灭菌发酵生产下游处理发酵设备•发酵工程无菌技术：–纯培养发酵技术：发酵全过程只有生产菌，无杂菌第五章灭菌及无菌空气制备•在发酵过程中夹杂其它杂菌造成的不良后果：–杂菌污染使基质或产物被杂菌消耗，造成生产能力下降；–杂菌产生的某些代谢产物，改变了培养液的理化性质，使提取精制发生困难；–杂菌可能会降解目的产物，使得生产过程失败；–杂菌会污染最终产品；–发酵时如污染噬菌体，可使生产菌发生溶菌现象，使生产失败为了保证培养过程的正常进行，在接种要培养的微生物之前，需要进行灭菌与消毒。灭菌对象：培养基；设备与管道；空气系统；流加料、消泡剂；必要时还有对生产环境进行消毒，防止杂菌和噬菌体•工业上具体措施包括：–1）使用的培养基和设备须经灭菌；–2）好氧培养中使用的空气应经除菌处理–3）设备应严密，发酵罐维持正压环境；–4）培养过程中加入的物料应经过灭菌；–5）使用无污染的种子。•消毒与灭菌在发酵工业中的应用消毒(disinfection)：用物理或化学方法杀死物料、容器器具内外病原微生物，而对被消毒的物体基本无害的措施。一般只能杀死营养细胞，例如巴氏消毒法（60℃，30min）。灭菌(sterilization)：用物理或化学方法杀死或除去物料、空气容器等环境中所有微生物，包括营养细胞、细菌芽孢和孢子。关系：消毒不一定达到灭菌的要求，而灭菌可以达到消毒的目的。常用消毒、灭菌原理与方法•化学药剂消毒：甲醛或新洁尔灭、高锰酸钾等–使蛋白质凝固变性、酶失活；破坏细胞膜；•物理方法–辐射灭菌：紫外线、X射线，高能辐射与菌体核酸光化学反应–干热灭菌法：氧化作用、高温使蛋白质变性和电解质浓缩中毒–湿热灭菌法（最常用）：蒸汽热使蛋白质变性，大分子氢键收到破坏；–过滤介质除菌√：微生物不能透过滤膜而除菌湿热灭菌法•蒸汽具有强的热穿透力，灭菌易于彻底，效果最好，应用饱和蒸汽进行灭菌最为普遍。适用范围：广泛应用于生产设备及培养基的灭菌•例如：实验室内的高压蒸汽灭菌、发酵车间采用的设备空消和培养基实消。过滤介质除菌法•过滤介质除菌–采用适当的过滤介质对热敏性的液体或气体进行过滤，去除微生物的方法。–液体：0.22μm或0.45μm滤膜–气体：纤维介质滤材捕捉极微小的悬浮微生物适用范围：对压缩空气制备无菌空气；酶溶液、啤酒及其他不耐热化合物溶液除菌。高压蒸汽灭菌利用饱和蒸汽的高温杀死微生物的同时，高温还可能造成培养基成分的损失。培养基灭菌的要求：•达到要求的无菌程度•尽量减少营养成分的破坏。在灭菌过程中，培养基组分的破坏，是由两个基本类型的反应引起的：–培养基中不同营养成分间的相互作用；–对热不稳定的组分如氨基酸和维生素等的分解•合理选择灭菌条件的关键：了解灭菌温度、时间对微生物死亡和培养基成分破坏的关系。第一节培养基和发酵设备的灭菌致死温度：杀死微生物的极限（最低）温度。在致死温度下，杀死全部微生物所需要的时间成为致死时间；在致死温度以上，温度愈高，致死时间愈短。用湿热灭菌方法对培养基灭菌时，加热的温度和时间对微生物死亡和营养成分均有破坏作用，因而选择一种既能达到灭菌要求又能减少营养成分被破坏的温度和受热时间，是研究培养基灭菌质量的重要内容。培养基的营养成分的破坏和菌体死亡都符合ArrheniusEquation方程:一、培养基的灭菌温度选择微生物营养成分反应速度常数增加的倍数K值为比死亡速率反应速率常数k是微生物耐热性的一种特征，它随微生物的种类和灭菌温度而异。T相同，k值越小，则微生物越是耐热。同一种微生物在不同灭菌温度下，k值不同，灭菌温度越低，k值越小，温度越高，k值增大。细菌芽孢名称k值/min-1枯草芽孢杆菌FS52303.8~2.6硬脂嗜热芽孢杆菌FS15180.77硬脂嗜热芽孢杆菌FS6172.9产气梭状芽孢杆菌PA36791.8121℃某些细菌芽孢的k值随温度的升高，灭菌反应速度常数增加的倍数大于营养成分破坏反应速度常数增加的倍数。•达到相同灭菌效果时，温度T越高，K值越大（比死亡速率常数），所需灭菌的时间t越短。•在实际生产中为了既达到灭菌目的又较好地保存营养成分，最好采用较高的温度，较短时间进行灭菌，瞬时高温灭菌UHT。即可达到杀死培养基中的全部微生物的目的，又可减少营养成分的破坏。•通常情况选择灭菌温度为121℃，当培养基中含热敏成分，则降低温度微生物营养成分芽孢VB2118℃,15min99.99%10%120℃,1.5min99.99%5%在确定了培养基灭菌的温度后，如何来计算灭菌时间？toNNktlog303.2t:发酵培养基的灭菌时间k:比死亡速率，min-1,不同微生物在某一温度下的k值差异N0:开始灭菌时培养基物料中的活菌数，污染程度Nt:培养基经灭菌时间t后中的残留活菌数（灭菌程度一般为0.001，即1000次有一次失败），灭菌程度在计算灭菌时间过程中需考虑两个问题：一是一般只考虑芽孢细菌和细菌的芽孢数之和作为计算依据；二是灭菌程度，即残留菌数，一般采用Nt=0.001，即1000次灭菌中有一次失败。1．培养基pH值：培养基中氢离子浓度直接影响灭菌的效果。培养基的pH值越低，所需杀灭微生物的温度越低。pH6.0-8.0时最难灭菌。温度（℃）孢子数（个/mL)灭菌时间（min）pH6.1pH5.3pH5.0pH4.7pH4.5120115110100100001000010000100008257074072565720512351803133015031324150pH值对灭菌时间的影响二、影响培养基灭菌的其它因素除了灭菌温度和时间外，影响灭菌效果的因素还有：2、培养基成分：•油脂、糖类及一定浓度的蛋白质可增加微生物耐热性；–大肠杆菌E.coli在水中加热60-65℃死亡；在10%糖溶液中，需要70℃加热4~6min，在30%糖溶液中，需要加热30min。•另一些物质，如高浓度的盐类、色素等的存在等可削弱其耐热性3、泡沫：•对灭菌极为不利，泡沫中的空气形成隔热层，使传热困难，热难穿透。在易产生泡沫的培养基中加入消泡剂。影响灭菌效果的因素4、培养基中微生物数量微生物数量越多，达到要求灭菌效果所需时间也越长。培养基中微生物孢子数/（个/ml）9900900009000000900000000105℃灭菌所需时间/min214203648培养基中微生物孢子在105℃灭菌所需时间在实际生产中，不宜采用严重霉变的原料和腐败的水质。影响灭菌效果的因素•5、培养基的物理状态固体培养基比液体培养基灭菌时间长；颗粒越大，灭菌时蒸汽穿透所需时间越长，灭菌难，对于小于1mm的颗粒培养基，不必考虑颗粒对灭菌的影响，但含有少量大颗粒和粗纤维的培养基的灭菌，则要适当提高温度，在不影响培养基质量的条件下，采用粗过滤的方法预先处理，以防止培养基结块而造成灭菌不彻底。6.其他：微生物细胞的含水量、菌龄、搅拌和空气排除情况等会影响培养基的灭菌效果。三、发酵培养基灭菌工艺1、分批灭菌（实罐灭菌，实消）2、连续灭菌（连消）3、固体灭菌（一）分批灭菌分批灭菌也叫间歇灭菌或实罐灭菌、实消。培养基的分批灭菌就是将配制好的培养基放在发酵罐或其他装置中，通入蒸汽将培养基和所用设备一起进行加热灭菌的过程，也称为实罐灭菌，或实消。优点：无需其他附属设备，操作简便；缺点：加热和冷却时间长，营养成分有一定损失，不能采用高温快速灭菌一般采用121℃分批灭菌的时间计算若不计升温阶段所杀灭的菌数，把培养基中所有的菌均看成在保温阶段被杀死，可粗略计算灭菌所需时间。例：发酵罐内装40m3培养基，在温度121℃下进行实罐灭菌。原污染程度为每毫升2×105感染耐热细菌芽孢，121℃时灭菌速率常数为1.8min-1，求灭菌失败概率为0.001时所需要的灭菌时间。解：N0=40×106×2×105（个）Nt=0.001（个）k=1.8min-1㏑灭菌时间：t=N0Nt1k=2.3031.8㏒（8×1015）=20.34（min）24016012080时间（min)050100150温度升温冷却保温分批灭菌过程包括：升温、保温和冷却等三个阶段。各阶段对灭菌的贡献：20%、75%、5%。应当避免长时间的升温加热阶段，因为加热时间过长，不仅破坏营养物质，而且也有可能引起培养液中某些有害物质的生成，从而影响培养过程的顺利进行。分批灭菌温度变化曲线分批灭菌的工艺操作操作过程：1、空罐准备：清洗、检修和检测2、升温：把培养基加热到灭菌所需的温度，夹套和直接通蒸汽加热3、保温维持：在灭菌温度下保持灭菌所需时间4、冷却保压：把培养基降低到接种的温度三路进汽：蒸汽直接从通风、取样和出料口进入罐内直接加热，直到所规定的温度，并维持一定的时间。这就是所谓的“三路进气”。四路出汽：直接蒸汽从排气、接种、进料和消沫剂管排气分批灭菌设备示意图•思考：灭菌过程培养基的体积和成份变化，对发酵过程有何影响？优点：不需要专门的设备，投资少，对设备要求简单，对蒸汽的要求也比较低，而且灭菌效果可靠。连续灭菌时，培养基可在短时间内加热到保温温度，并且能很快地被冷却；因此可在比分批灭菌更高的温度下进行灭菌；而由于灭菌温度很高，保温时间就相应地可以很短，极有利于减少培养基中的营养物质的破坏。（二）连续灭菌1、连续灭菌的温度变化培养基的连续灭菌就是将配制好的培养基在向发酵罐等培养装置输送的同时进行加热、保温和冷却而进行灭菌。连续灭菌时间的计算：连续灭菌的时间的计算，含菌数应改为每毫升培养基的含菌数。例：发酵罐内装40m3培养基，在温度131℃下进行连续灭菌。原污染程度为每毫升2×105感染耐热细菌芽孢，131℃时灭菌速率常数为15min-1，求所需要的灭菌时间。解：c0=2×105（个/ml）ct=1/40×106×103=2.5×10-11（个/ml）k=15min-1㏑灭菌时间：t=C0Ct1k=2.30315㏒（）=2.37（min）2×1052.5×10-11连续灭菌的工艺流程①配料预热罐：预热到60~70℃，避免连续灭菌时由于料液与蒸汽温度相差过大而产生水汽撞击声音。②连消塔：使高温蒸汽与料液迅速解除混合，使料液温度很快上升到灭菌温度（126~132℃）③维持罐：使料液在灭菌温度下保持5~7min，以达到灭菌目的；④冷却管：生产上一般采用冷水喷淋冷却到40~50℃后，输送到灭菌的罐内分批灭菌和连续灭菌的比较灭菌方式优点缺点连续灭菌1.灭菌温度高，减少营养物质损失2.操作条件恒定，灭菌质量稳定3.易于实现管道化和自控操作4.避免反复加热冷却，提高热利用率5.发酵设备利用率高1.对设备要求高，需要设置加热和冷却装置2.操作麻烦3.染菌的机会多4.不适合含大量固体物料的灭菌5.对蒸汽的要求高间歇分批1.设备要求低，不需另外设置加热好冷却装置2.操作要求低，适于手动操作3.适合于小批量生产4.适合于含有大量固体物质的培养基的灭菌1.培养基营养物质损失多，灭菌后培养基质量下降2.需要反复的加热和冷却，能耗较大3.不适于大规模生产过程的灭菌4.发酵罐的利用率低设备灭菌，又称空消(Stearilizationoffermenter)实罐灭菌时，发酵罐与培养基一起灭菌（实消）•培养基采用连续灭菌时，发酵罐需在培养基灭菌加入前进行空消，通常是用蒸汽加热发酵罐的夹套或设管并从空气分布管中通入蒸汽，充满整个容器后，再从排气管中缓缓排出。容器内的蒸汽压力保持1公斤，20分钟。•管道、空气过滤器、补料罐、计量贮存罐发酵附属设备灭菌四、培养基和设备、管路灭菌的条件1、种子罐、发酵罐、计量罐、补料罐等的空罐及管道灭菌从有关管道通入蒸汽，使罐内蒸汽压力达0.147Mpa。维持45min，灭菌过程从有关阀门排出空气，并使争取通过达到死角灭菌；灭菌结束，关闭蒸汽后，待罐内压力低于空气过滤器压力时，通入无菌空气保压0.098Mpa。2、空气总过滤器和分过滤器灭菌排出过滤器中空气，从过滤器上部通入蒸汽，并从下、下排气口排气，维持压力0.147Mpa，灭菌2h，灭菌完毕通入压缩空气吹干。3、种子培养